[发明专利]1．3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法

摘要

本发明提供了一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法。所述方法是通过囊胚注射ES细胞制备定点整合1.3拷贝C基因型乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）转基因小鼠。首先构建定点整合1.3拷贝C型HBV的表达载体，然后采用电转导转化方法把重组质粒转化到ES细胞中，经过筛选和培养后获得定点整合重组的ES细胞，再把定点整合重组的ES细胞经消化成单个细胞后注射到囊胚中，然后把囊胚移植到假孕母鼠子宫中。该方法在国内外率先建立了1.3拷贝C型HBV的转基因小鼠，针对性的应用于乙肝相关研究领域中，为我国乙型肝炎预防和治疗研究更加理想的动物模型。

主权项

一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法，其特征在于，步骤如下：S1.胚胎干细胞系的建立；S2.将1.3倍加长片段C型HBV质粒电转导到胚胎干细胞，经过鉴定得到阳性的胚胎干细胞，进行扩大培养；S3.把阳性胚胎干细胞注射到囊胚中，将注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宫，培育得到1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠；其中，步骤S2所述电转导的方法如下：S21.将培养的胚胎干细胞系用胰酶消化为单个细胞，加入终止培养基终止消化，离心，去除上清，然后用减血清培养基opti‑MEM进行悬浮；S22.悬浮液中加入电转导所需的C型HBV质粒，混匀，转移到电转杯中，用电转仪进行电转导，电转导后迅速加入细胞培养基，然后铺到细胞板中；S23.第二天，更换培养基为嘌呤霉素抗性的培养基，每天进行换液；S24.培养5～7天后，只有转入了质粒的细胞才能生长成集落克隆，分别挑取筛选出来的克隆到细胞板中，每个孔1个细胞克隆；S25.第二天，将细胞传代到新的细胞板中，再次长满后，细胞用于提取DNA进行PCR鉴定，得到阳性克隆；S26.将得到的阳性克隆的细胞进行扩大培养，得到阳性胚胎干细胞系；其中，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞，所述胚胎干细胞系为小鼠胚胎干细胞系。