[发明专利]用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT-PCR检测方法

摘要

本发明公开一种用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT‑PCR检测方法，提供了一对全新的简并引物，应用反转录和降落PCR技术对艾美尔属球虫病毒进行特异性的简并引物RT‑PCR扩增。本发明简并引物RT‑PCR方法可有效检测柔嫩艾美尔球虫病毒和斯氏艾美尔球虫病毒存在，并且专一性好(电泳条带单一)。为首次用于艾美尔属球虫病毒检测的方法，可以快速准确的识别待检球虫样本中是否含有携病毒的虫株。

主权项

1.一种用于非疾病诊断和治疗目的的艾美尔属球虫病毒的简并引物RT‑PCR检测方法，包括以下步骤：1）在STE缓冲液的条件下，使用苯酚氯仿对经过液氮研磨的球虫材料进行抽提，获取总核酸，总核酸中的DNA经由DNaseI消化处理，获取RNA的粗提产物，即为待检核酸样品；2）该待检核酸样品直接作为模板，使用PrimeScript™ Reverse Transcriptase反转录酶进行反转录（RT）；因为球虫病毒基因组为dsRNA，所以反转录使用CF和CR两条简并引物同时进行；上游引物：CF：5’‑CBGCIGCTBYIGTVGCH‑3’；下游引物：CR：5’‑GTVGRCTCDATCCARAASHAD‑3’；以上CF引物使用了I（次黄嘌呤），代替N（N=A/T/C/G）；其中兼并碱基代码：R=A/G、S=G/C、Y=C/T、V=A/G/C、H=A/C/T、D=A/G/T、B=G/C/T、N=A/G/C/T；3）经由反转录所得到的cDNA使用TaKaRa LA Taq 核酸聚合酶进行PCR扩增为dsDNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果。