[发明专利]一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法

摘要

本发明提出了一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法，它包括：a.幼花的选择；b.幼花的前处理和消毒；c.幼花愈伤组织诱导；d.愈伤组织分化培养；e.芽苗分化出根；f.组培苗的移栽；g.组培植株的观察鉴定。本发明突出幼花为外植体具有再生能力强、可在冬季至早春进行多倍体组培繁殖的优势，解决了多倍体毛泡桐根段繁殖率低和叶片组培繁殖分化苗频率不高的问题，能够较大规模繁殖多倍体毛泡桐，并利用形态学和细胞学技术确定组培后代的多倍体真实性和一致性。

主权项

一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法，其特征在于培育过程为：a.幼花的选择组织培养的材料是新近选育的多倍体毛泡桐品系，其与一般二倍体毛泡桐品系在形态结构和染色体组成上是不同的，它在11月到次年4月初进行花朵发育，应用的外植体是多倍体毛泡桐的幼花，选择的多倍体毛泡桐的幼花需饱满、呈黄褐色小纺锤形，无病虫害；b.幼花的前处理和消毒将着生幼花的多倍体无毛泡桐花枝采回，插入装有35 ℃到40 ℃热水的水瓶中，外罩塑料袋并放在25 ℃到28 ℃的组培室内处理3到4天，以促动幼花发育，热水处理后，采摘下幼花放置在超净工作台上，用解剖刀沿着幼花表面切割去除幼花的黄褐色花萼，然后将幼花进行一般消毒处理，无菌水冲洗3次后，将幼花纵横切开，切成0.5 cm的小块；c.幼花愈伤组织诱导将多倍体毛泡桐幼花小块接种到幼花愈伤组织诱导培养基中，置于黑暗、25 ℃～28 ℃ 条件下培养，25天～30天幼花小块切口处产生淡黄色愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基配方为：MS+8.0 mg/L～16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L～0.9 mg/L NAA+3%蔗糖+0.75%琼脂，pH5.8～6.0；d.愈伤组织分化培养挑出直径达1 cm以上生长旺盛的愈伤组织，将它们接种到多倍体毛泡桐愈伤细胞分化培养基中，置于25 ℃～26 ℃，2000 Lx～2500 Lx，光照10 hr‑11 hr，黑暗14 h～13 h；30天～45天后愈伤细胞由淡黄变为乳黄色，松紧中等，后逐渐显现绿色小点而分化出小芽，并逐渐长高长粗壮，愈伤组织分化培养基配方为：MS+6‑BA 3.0mg/L～5.0 mg/L + IBA 1.0mg/L ～2.0 mg/L +2%蔗糖+0.75%琼脂，pH5.8～6.0；e.芽苗分化出根当芽苗生长粗壮，达2.5 cm～5.0 cm高时，将它们连带小块愈伤组织一起或从基部切断转接到生根培养基中，约15天～25天，芽苗基部分化出根，生根培养基的配方为：1/2MS+ IBA 2.5mg/L ～3.0mg/L + 0.01%活性炭+2%蔗糖+0.75%琼脂，pH5.8～6.0；f.组织苗的移栽当组培苗生长旺盛健壮，苗高达到8.0 cm～15.0 cm时，将它们连同培养瓶转入18 ℃～20 ℃室内，光照2000 Lx，炼苗3天，然后打开瓶盖加入无菌水5 mL，再放置2天后，将组培苗移出瓶，用自来水彻底洗涤，最后在加有1.0%～1.5%高锰酸钾液中浸5 min，最后移栽到由细砂土、蛭石和泥炭土组成并灭菌的基质中，用1/10MS培养基浇足定根水后，上罩塑料膜，保持相对湿度80%～90%，温度23 ℃～25 ℃，光照1000 Lx～1500 Lx，24 h，此后按一般试管苗方法管理；g.组培植株的观察鉴定随着组织苗在移植基质中生长，多倍体毛泡桐将不断变粗壮长高，此时，观察组培苗是否表现一致，是否表现出多倍体毛泡桐的叶片形状（多倍体毛泡桐叶片厚实，为近圆形）和边缘缺刻（比二倍体变小），并观察叶片的下表皮气孔密度和气孔大小，以确是组培苗为多倍体毛泡桐的真实克隆品系。