[发明专利]干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法

摘要

本发明涉及一种干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤：胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增；依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化；含HIF-1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建；大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析：表达产物的测定和生物活性分析。本发明的干细胞分化及鉴定的方法性能稳定。

主权项

干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤：（1）胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增 严格无菌条件下，在DMEM细胞培养基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS冲洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生长细胞培养基，用吸管吹打制成单细胞悬液，移入培养瓶；原代细胞克隆形成后再次机械分离制成单细胞悬液，每7‑10天传代一次，方法同前；低温保存时，全生长细胞培养基中加入10%DMSO；在传代同时并进行克隆形成实验，用免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM 确定细胞类型；（2）依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化依赖EGF和FGF的神经球细胞转移到12孔细胞培养板，在EGF或FGF和以下一种或数种因子联合作用下培养4‑8天：PDGF、NT‑3、BDNF、NGF、EGF、FCS、FGF、顺式视黄酸；免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM 、NeuN确定细胞类型；（3）含HIF‑1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建 1）鼠HIF‑1α的克隆：鼠肝癌细胞系Hepalclc7提取 总RNART‑PCR HIF‑1αcDNA（核心序列约2.5Kb）酶切连接质粒重组质粒—转化细菌—筛选菌落， 2）质粒pGEM‑3zf(+)‑GDNF由中科院分子免疫中心提供，转化细菌—筛选菌落， 3）目的基因的阳离子脂质体的包装和测定， 4） 表达载体的鉴定：酶切、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺电泳分析HIF‑1α、GDNF基因并验证其表达的正确性；（4）大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析：含目的基因的阳离子脂质体与培养的神经干细胞共同孵育1小时，然后置于含G418的细胞培养板培养24小时，收集新霉素抗性克隆；台盘蓝染色，至移植时，在HBSS中分离成单细胞悬液，重新放于全生长细胞培养基，确定细胞活性及密度为105细胞/μl，移植后，剩余的细胞行组织化学法及免疫细胞化学法检测类型等，并检测β‑gal与GDNF、HIF‑1α表达的相关性；（5）表达产物的测定和生物活性分析：采用Western blot法和Slot blot法验证GDNF、HIF‑1α的表达，应用E8鸡胚DRG检测GDNF的生物活性；采用Western blot法、免疫组织化学法从蛋白质水平测定HIF‑1α的生物活性。