[发明专利]一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法

摘要

本发明提供的是一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法，采用杆状病毒的稀释、杆状病毒的固定、杆状病毒的透化、杆状病毒的染色、染色后的杆状病毒在高效液相色谱仪上进行标准曲线的制定和待测样品的定量;按上述方法同时进行待测杆状病毒的稀释、杆状病毒的固定、杆状病毒的透化、杆状病毒的染色、染色后色杆状病毒在高效液相色谱仪上测定样品的最大吸收峰值，根据确立的标准曲线计算样品的待测样品的病毒毒价。采用的新方法与常规方法相比，极大的缩短了杆状病毒定量的时间，提高了病毒定量的灵敏度，降低了实验成本，提高实验功效。

主权项

一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法，其特征在于：分步骤实施：1）杆状病毒的稀释：在冻存管中将已知和未知病毒毒价TCID₅₀的杆状病毒分别用磷酸缓冲液进行10倍梯度稀释；然后在冻存管中分别加入850μl的磷酸缓冲液和100μl梯度稀释好的病毒备用；    2）杆状病毒的固定：取1）稀释好的950μl杆状病毒，加入20μl 5%的多聚甲醛置于4℃作用1h后，将含有病毒的冻存管置于液氮中，放至10‑12min，在37℃水浴中溶解，固定完毕备用；3）杆状病毒的透化：取2）固定好的970μl杆状病毒，加入10μl 10%的TritonX‑100，室温反应5‑6min，透化完毕备用；4）杆状病毒的染色：取3）透化好的980μl杆状病毒中加入200μl的稀释好的染料，混匀后避光在80℃水浴作用10min，染色完毕备用；5）将染色后的杆状病毒，用0.45μm的滤膜过滤，取滤液200μl加入到液相色谱仪中检测，其中检测使用BioSep SEC‑s2000 色谱柱，上样缓冲液为pH值7.5的0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液，样品温度8℃，柱温60℃，流速1ml/min，上样量为5μl，荧光检测的吸收波长为 497nm，发射波长为520nm；6）取已知TCID₅₀的杆状病毒100μl，按倍数方法稀释制作标准曲线,利用标准曲线，得到6批未知样品的定量分析结果。