[发明专利]一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒

摘要

本发明涉及分析化学领域，公开了一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒。本发明利用人β-酪蛋白酶解后所获得的特异多肽序列VMPVLK，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法提供了一种全新的准确定量检测方法对人β-酪蛋白进行定量检测，具有较高的准确度、精密度和灵敏度。

主权项

一种定量检测人β‑酪蛋白含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，取10μL稀释母乳样品，然后加入20μmol/L同位素内标物溶液10μL、50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液945μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL酶解，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，以内标法获得人β‑酪蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；步骤2、取梯度浓度的人β‑酪蛋白特异肽标准品溶液各10μL，分别加入20μmol/L同位素特异肽标准品溶液10μL后用50mmol/L碳酸氢铵溶液975μL稀释，最后加入5μL体积百分比为0.1%的甲酸水溶液，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，获得人β‑酪蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的人β‑酪蛋白特异肽标准品溶液浓度的标准曲线，将步骤1得到的人β‑酪蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入标准曲线获得母乳样品中β‑酪蛋白特异肽的浓度，然后按下式计算获得人β‑酪蛋白含量；人β‑酪蛋白含量=母乳样品中β‑酪蛋白特异肽摩尔浓度×人β‑酪蛋白摩尔质量×母乳样品稀释倍数；其中，所述同位素内标物为如SEQ ID NO:1所示序列的多肽且从N端起第9位的缬氨酸和第10位的亮氨酸被碳氮全同位素标记，所述人β‑酪蛋白特异肽标准品和同位素特异肽标准品蛋白质序列均为如SEQ ID NO:2所示序列的多肽，且同位素特异肽标准品序列从N端起第4位的缬氨酸和第5位的亮氨酸被碳氮全同位素标记。