[发明专利]一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法

摘要

一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法，本方法选取生长健壮的大苞鞘石斛母株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育至基本成熟而未开裂时的果实作为外植体，并经过无菌播种、分化培养、增殖培养、生根培养、壮苗培养基试管苗移栽等繁殖步骤。本发明具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的试管苗，成苗的移栽成活率90%以上。能为大苞鞘石斛的种苗生产及资源保护提供一条有效的途径。

主权项

一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：（1）选材：大苞鞘石斛兰开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后果实成熟且外植体未开裂时作为外植体用播种；（2）萌发培养：将外植体用75% 酒精擦拭表面，洗洁精清洗30 min后自来水冲洗1 h，移置于超净工作台上，用75%的酒精消毒60 s，无菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并摇动，无菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛种胚，将种胚播于B5、绵白糖20 g/L‑1、椰乳20%、琼脂7.6 g/L‑1混合配制的pH 调节为5.4的萌发培养基上，培养50天，种胚萌发成原球茎;（3）分化培养：将原球茎转接于花宝1号3 g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2  mg/L、椰乳10% 、马铃薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的pH调节为5.6的分化培养基上进行分化培养，培养时间70 天，萌发后的绿色原球茎，接种10天后，最后形成完整植株小苗;（4）增殖培养：选取分化后的小苗接入CHB、NAA 0.5、6‑BA 0.2、椰乳10% 、蔗糖30 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的pH 调节为5.8的增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，培养150 天长成无菌大苗； （5）生根诱导培养：将增殖后的无菌大苗转入花宝2号3 g/L、蛋白胨2 g/L、IBA 1 mg/L、 椰乳 10%、 蔗糖30 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的pH 调节为5.6的生根诱导培养基进行生根诱导，培养45 天； （6）壮苗培养：将生根诱导的无菌苗在花宝1号3 g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L 、活性炭1 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的pH调节为5.6的壮苗培养基做壮苗生根培养，培养90 天；（7）试管苗移栽：无菌苗壮苗生根培养后栽植于1：1：0.5的松树皮+珍珠岩+兰花基石中，栽培基质采用121 ℃高压蒸汽灭菌消毒120 min，栽培条件为遮阴40%的自然光照条件，80%相对湿度，25~29℃。