[发明专利]一种艾塞那肽的固相片段合成方法

摘要

本发明公开了一种艾塞那肽的固相片段合成方法，将艾塞那肽的39个氨基酸分成6段全保护片段，先分别合成6段全保护片段，再将6段全保护片段依次进行固相片段组装连接，得到艾塞那肽树脂，然后切割，得到艾塞那肽粗品，粗品经纯化得到艾塞那肽产品。本发明克服了现有固相合成艾塞那肽过程复杂、效率低下、纯化困难、规模化困难的问题，提高了合成效率，大量简化了连接步骤，减少杂质累积，为有效解决艾塞那肽合成规模化，提高产品纯度，减小纯化难度提供了一种新方法。

主权项

一种艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于它由下述步骤组成：（1）合成Fmoc‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin①合成Fmoc‑Ser(tBu)‑MBHA Resin将Fmoc‑Rink Amide MBHA Resin用N,N‑二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N,N‑二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc‑两次，加入N,N‑二甲基甲酰胺、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、1‑羟基苯丙三唑、苯并三氮唑‑N,N,N′,N′‑四甲基脲四氟硼酸、N,N′‑二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc‑Ser(tBu)‑MBH A Resin；②合成Fmoc‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin将Fmoc‑Ser(tBu)‑MBHA Resin用哌啶与N,N‑二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc‑两次，加入N,N‑二甲基甲酰胺、Fmoc‑Pro‑OH、1‑羟基苯丙三唑、苯并三氮唑‑N,N,N′,N′‑四甲基脲四氟硼酸、N,N′‑二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin；③合成Fmoc‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin按照步骤②的方法向Fmoc‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin上依次连接Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Gly‑OH，得到Fmoc‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin；（2）合成Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑COOH①合成Fmoc‑Gly‑2‑CTC resin将2‑chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶胀后，加入二氯甲烷、Fmoc‑Gly‑OH、N,N′‑二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc‑Gly‑2‑CTC resin；②合成Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑2‑CTC resin按照步骤（1）中②的方法，向Fmoc‑Gly‑2‑CTC resin上依次连接Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH，得到Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑2‑CTC resin；③切割处理向Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑2‑CTC resin中加入切割液，常温搅拌1～3小时，过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑COOH；上述的切割液是三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:99或2:98的混合液，或者是三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:1:7的混合液；（3）合成Fmoc‑Val‑Arg(pbf)‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu(otBu)‑Trp‑Leu‑COOH按照步骤（2）中①的方法，向2‑chlorotrityl chloride resin上连接Fmoc‑Leu‑OH，得到Fmoc‑Leu‑2‑CTC resin，再按照步骤（2）中②的方法向Fmoc‑Leu‑2‑CTC resin 上依次连接Fomc‑Trp‑OH、Fmoc‑Glu(otBu)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Arg(pbf)‑OH、Fomc‑Val‑OH，得到Fmoc‑Val‑Arg(pbf)‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu(otBu)‑Trp‑Leu‑2‑CTC Resin，Fmoc‑Val‑Arg(pbf)‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu(otBu)‑Trp‑Leu‑2‑CTC Resin按照步骤（2）中③的方法进行切割处理，得到Fmoc‑Val‑Arg(pbf)‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu(otBu)‑Trp‑Leu‑COOH；（4）合成Fmoc‑Met‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Ala‑COOH按照步骤（2）中①的方法，向2‑chlorotrityl chloride resin上连接Fomc‑Ala‑OH，得到Fmoc‑Ala‑2‑CTC resin，再按照步骤（2）中②的方法向Fmoc‑Ala‑2‑CTC resin上依次连接Fomc‑Glu(otBu)‑OH、Fmoc‑Glu(otBu)‑OH、Fmoc‑Glu(otBu)‑OH、Fomc‑Met‑OH，得到Fmoc‑Met‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Ala‑2‑CTC Resin，Fmoc‑Met‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Ala‑2‑CTC Resin按照步骤（2）中③的方法进行切割处理，得到Fmoc‑Met‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Ala‑COOH；（5）合成Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(otBu)‑Leu‑Ser(tBu)‑Lys(Boc)‑Gln(Trt)‑COOH按照步骤（2）中①的方法，向2‑chlorotrityl chloride resin上连接Fomc‑Gln(Trt)‑OH，得到Fmoc‑Gln(Trt)‑2‑CTC resin，再按照步骤（2）中②的方法向Fmoc‑Gln(Trt)‑2‑CTC resin上依次连接Fomc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Asp(otBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fomc‑Thr(tBu)‑OH，得到Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(otBu)‑Leu‑Ser(tBu)‑Lys(Boc)‑Gln(Trt)‑2‑CTC Resin，Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(otBu)‑Leu‑Ser(tBu)‑Lys(Boc)‑Gln(Trt)‑2‑CTC Resin按照步骤（2）中③的方法进行切割处理，得到Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(otBu)‑Leu‑Ser(tBu)‑Lys(Boc)‑Gln(Trt)‑COOH；（6）合成Fmoc‑His(Trt)‑Gly‑Glu(otBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑COOH按照步骤（2）中①的方法，向2‑chlorotrityl chloride resin上连接Fomc‑Phe‑OH，得到Fmoc‑Phe‑2‑CTC resin，再按照步骤（2）中②的方法向Fmoc‑Phe‑2‑CTC resin上依次连接Fomc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Glu(otBu)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fomc‑His(Trt)‑OH，得到Fmoc‑His(Trt)‑Gly‑Glu(otBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑2‑CTC Resin，Fmoc‑His(Trt)‑Gly‑Glu(otBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑2‑CTC Resin按照步骤（2）中③的方法进行切割处理，得到Fmoc‑His(Trt)‑Gly‑Glu(otBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑COOH；（7）合成艾塞那肽①组装连接Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin将步骤（1）得到的Fmoc‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin用哌啶与N,N‑二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc‑两次，加入N,N‑二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N‑甲基吡咯烷酮的体积比为0.5～1:1～2:1的混合液以及Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑COOH、1‑羟基苯丙三唑、苯并三氮唑‑N,N,N′,N′‑四甲基脲四氟硼酸、N,N′‑二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3～4小时，得到Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin；②组装连接艾塞那肽按照步骤①的组装连接方法，向Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser(tBu)‑MBHA Resin上依次组装连接Fmoc‑Val‑Arg(pbf)‑Leu‑Phe‑Ile‑Glu(otBu)‑Trp‑Leu‑COOH、Fmoc‑Met‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Glu(otBu)‑Ala‑COOH、Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(otBu)‑Leu‑Ser(tBu)‑Lys(Boc)‑Gln(Trt)‑COOH、Fmoc‑His(Trt)‑Gly‑Glu(otBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑COOH，用哌啶与N,N‑二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc‑两次，得到艾塞那肽树脂，用质量百分比组成为三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三异丙基硅烷5%的切割液按照步骤（2）中③的方法对艾塞那肽树脂进行切割处理，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽。