[发明专利]中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用

摘要

本发明属于基因产品开发与应用领域，涉及中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用。本发明的技术方案为：中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：1）构建comt/pPIC9K重组表达载体；2）获得转化子高拷贝的毕赤酵母表达菌株comt/pPIC9K/KM71；3）转化子的发酵培养与诱导表达；4）COMT纯化。该法用真核‑‑‑‑毕赤酵母生产与制备的儿茶酚‑氧位‑甲基转移酶（COMT）有翻译后的修饰，结构更天然，酶活性更高，直接用酵母液纯化，省去了原核菌体回收、破碎的繁琐步骤，降低了生产成本，提高了纯化效率。

主权项

1.中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，其特征在于包括以下步骤：1)构建comt/pPIC9K重组表达载体；2)获得转化子高拷贝的毕赤酵母表达菌株comt/pPIC9K/KM71；3)转化子的发酵培养与诱导表达；4)COMT纯化；所述步骤1)为采用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌混合液诱导的中国对虾cDNA为模板，合成包含EcoR I与Not I内切酶位点的正反向引物，引物序列为：COMT ExF：5’‑TACTCAGAATTCATGTCTTCTCTGAAGAGTTAC‑3’COMT ExR：5’‑TACTCAGCGGCCGC TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TTTTTTAAAACAGAGAGACAAGC‑3’经聚合酶链式反应，扩增出666bp的COMT的ORF，将其克隆入pPIC9K质粒，构建comt/pPIC9K重组表达载体；所述步骤2)为将构建好的comt/pPIC9K表达载体用Sal I酶切线性化，电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71感受态细胞，线性化的载体将利用AOX基因同源重组到酵母的基因组中，通过筛选获得高拷贝的表达菌株comt/pPIC9K/KM71；所述步骤3)为将筛选出的高拷贝表达菌株comt/pPIC9K/KM71先接种到BMGY培养基上扩繁制种，再向发酵罐加入基础盐培养基灭菌，待其冷却到30℃，搅拌通气，调溶氧至100％，调pH至5.0，接5％的菌种，经适当提高转速、通气量，在30℃、pH5.0的条件下初始培养24h，间歇流加补料1，继续培养12h后，再流加补料2诱导表达COMT酶蛋白；加补料2的流速开始为1mL/h/L，以后每30min提高10％，直到3mL/h/L并一直保持发酵到130h后结束；所述基础盐培养基、补料1和补料2的加入量体积比为8：1：1；所述基础盐培养基为下述成份加去离子水至1L：质量浓度为85％的H₃PO₄：26.7ml、CaSO₄：0.93g、K₂SO₄：18.2g、MgSO₄·7H₂O：14.9g、KOH：4.13g、甘油：40g、微量盐溶液：4.35ML；所述补料1为下述成分加去离子水至1L：甘油：500g、微量盐溶液：12ml；所述补料2为：甲醇：1000ml、微量盐溶液：12ml；上述微量盐溶液为下述成份加去离子水至1L，并过滤除菌：FeSO₄·7H₂O：65g、ZnCl₂：20g、CuSO₄·5H₂O：6g、MnSO₄·H₂O：3g、Co Cl₂·6H₂O：0.5g、Na₂MoO₄·2H₂O：0.2g、NaI：0.08g、H₃BO₃：0.02g、生物素：0.2g、H₂SO₄：5ml；所述步骤4)为将酵母发酵液经12000rpm离心5min，让上清液慢慢流经His‑Bind亲和层析柱，再用含咪唑的pH7.9的洗脱液把结合到柱子上的COMT酶蛋白洗脱下来，即获得纯的COMT酶蛋白，所述洗脱液的组成为：0.5M NaCl、20mM Tris‑HCl和1M imidazole。