[发明专利]成骨生长肽碳端五肽的合成方法

摘要

一种成骨生长肽碳端五肽的合成方法，由以下步骤组成：合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化，依次合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH、NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH、NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。

主权项

一种成骨生长肽碳端五肽的合成方法，由下述步骤组成：⑴合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOSu将Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOH置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOH加入10mL1,4‑二氧六环，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺，再加入二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOH与氮羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应10～12小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液为溶有Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOSu的1,4‑二氧六环溶液；⑵合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑OH将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOSu的1,4‑二氧六环溶液中，Fmoc‑Tyr(tbu)‑COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应5～8小时，减压蒸除二氧六环，加1～5倍混合液体积的乙醚，搅拌，用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调pH至2～3，析出白色固体，减压过滤收集白色固体，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑OH；⑶Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑OH活化将Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑OH置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑OH加入10mL乙酸乙酯，室温搅拌，加入氮羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，再加入二环己基碳二亚胺，搅拌至溶解，Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑OH与氮羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应12～15小时，减压过滤除去固体不溶物，滤液减压浓缩至干，得Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑COOSu或Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑ONp；⑷合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑OH将步骤（3）所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑COOSu或Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑ONp加入10mL四氢呋喃，室温搅拌，至完全溶解；将0.5mM/mL的苯丙氨酸悬浮液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑COOSu或Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑ONp的四氢呋喃溶液中，苯丙氨酸与碳酸氢钠、Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑COOSu或Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑ONp的摩尔比为1.2～1.8：1.2～2：1，室温搅拌反应8～10小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH至2～3，有白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑OH；⑸合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑COOSu将Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑OH置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑OH加入10mL1,4‑二氧六环，采用步骤（1）的反应条件进行化学反应，得到溶有Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑COOSu的1,4‑二氧六环溶液；⑹合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑OH将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑COOSu的1,4‑二氧六环溶液中，Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑COOSu与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应10～15小时，减压蒸除二氧六环，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH为2～3，加乙酸乙酯萃取，分离有机相，有机相依次用水、质量浓度为26.5%氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑OH粗品，用正己烷与乙醚体积比为1：3的混合液40KHz超声洗涤三次，真空干燥箱内40℃以下干燥，得到Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑OH纯品；⑺合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑ONp将Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑OH置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑OH加入15mL二氯甲烷，室温搅拌，加入对硝基苯酚，再加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌至溶解，Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑OH与对硝基苯酚、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温反应15～17小时，水洗涤除去盐，有机相减压浓缩至干，得Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑ONp；⑻合成Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH将步骤（7）所得的产物置于反应瓶中，按每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑ONp加入15mL四氢呋喃，室温搅拌至完全溶解；将0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氢钠水溶液等体积混合，混合液滴加到Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑ONp的四氢呋喃溶液中，Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑ONp与甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1：1.2～1.8：1.2～2，室温搅拌反应10～15小时，减压蒸除四氢呋喃，用质量分数为10%柠檬酸溶液调pH至2～3，白色固体析出，减压过滤，蒸馏水淋洗滤饼，真空干燥箱内40℃以下干燥，得Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH粗品，柱色谱分离，用乙酸乙酯冲洗杂质，再用甲醇与乙酸乙酯体积比为1：3的混合液冲洗目标物，收集，减压蒸干，得到Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH纯品；⑼合成NH2‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH在每克Fmoc‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH中加入10mL哌啶与1,4‑二氧六环体积比为1：9的混合液，室温反应30分钟，减压蒸干，用水溶解，用二氯甲烷萃除杂质，水相减压浓缩至干，得NH2‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH；⑽合成NH2‑Tyr‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH在每克NH2‑Tyr(tbu)‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH中加入10mL体积分数为95%的三氟乙酸水溶液，室温反应10分钟，减压浓缩，加浓缩体积7倍量的冷冻乙醚，搅拌，离心，分离出上清液，固体经真空干燥箱内40℃以下干燥，得NH2‑Tyr‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、 冻干得纯度大于93%的序列为NH2‑Tyr‑Gly‑Phe‑Gly‑Gly‑OH的成骨生长肽碳端五肽。