[发明专利]一种碱性细菌漆酶在酵母中的高通量表达方法

摘要

本发明公开了一种碱性细菌漆酶在酵母中的高通量表达方法，包括以下步骤A、带有碱性细菌漆酶基因的毕赤酵母表达载体构建；B、阳性转化子的筛选；C、酵母表达载体的线性化；D、酵母电转感受态的制备E、重组子的表达鉴定；F、融合蛋白的纯化；G、酶动力学参数测定。本发明通过基于语义的模型发现来帮助建模者，更加高效、合理的完成模型的组合建模，从而解决了碱性细菌漆酶在原核表达系统中易形成包涵体及产量、酶活性低的问题。

主权项

一种碱性细菌漆酶在酵母中的高通量表达方法，其特征在于，包括以下步骤：A、带有碱性细菌漆酶基因的毕赤酵母表达载体构建(1)从一株苍白杆菌基因组扩增得到漆酶编码基因，命名为511lac经测序鉴定如：SEQ ID NO：1所示；(2)在50μl的体系中，加入5μl 10×限制性内切酶反应缓冲液，并按1μg DNA∶3‑5U限制性内切酶的比例加入DNA和限制性内切酶Cpo I和Not I，混匀后37℃保温2‑12h，使用该方法分别用相同的限制性内切酶消化切割pPic9K质粒DNA和已扩增的细菌漆酶基因DNA，在基因终止密码子后设计一段组氨酸标签；(3)用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段；(4)在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T4DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例加入限制性内切酶消化过的pPic9k质粒DNA和细菌漆酶基因DNA，再加入1μl T4DNA连接酶，16℃水浴4‑12h将细菌漆酶基因插入pPic9K质粒上的多克隆位点形成一个重组表达质粒；B、阳性转化子的筛选利用常规的CaCl2法制备E.coli DH10B感受态细胞，然后将5‑10μl连接反应混合物与100ul E.coli DH10B感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热休克1.5min后立即置冰上5min，加入900μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养45min，摇床转速为150rpm，然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素Amp的LB平板上，37℃培养12h，平板上长出的单个菌落即为阳性转化子；C、酵母表达载体的线性化Sal I分别酶切原始载体重组载体pPic9K‑laccase，1％琼脂糖凝胶回收含目的基因的重组线性化载体，15ul ddH2O‑20℃保存备用；D、酵母电转感受态的制备挑取单克隆GS115接种于10ml YPD液体培养基中，200rpm/min，30℃摇床培养过夜，以1％接种量转接至100ml YPD液体培养基，30℃摇床过夜OD＝1.1‑1.3，在4℃离心5000rpm，5min，弃上清，用100ml冰预冷无菌水重悬菌体，重复1次，在4℃离心5000rpm，5min，弃上清，用20ml冰预冷1mol/L的山梨醇重悬菌体，重复1次，山梨醇的量减为5ml，最后在4℃6000rpm，8min离心弃上清，用400ul冰预冷1mol/L的山梨醇重悬均匀，按100ul分装于1.5ml预冷无菌EP管中，零度备用；E、重组子的表达鉴定挑取MD平板上的转化子接于5ml BMGY：0.1mol/L PB pH6.0，CuSO40.4mmol/L中，标记菌株后置于30度摇床200rpm/min过夜培养，直到OD600为2.5时，8000rpm/min离心5分钟，去上清，每管以5ml BMMY：0.1mol/L PB pH6.0，0.5％甲醇，CuSO40.4mmol/L重悬，200rpm/min转速下30度摇床诱导培养，每隔24小时补加5％的甲醇，从第36小时开始以ABTS检测漆酶活性，每隔12小时取100ul菌液，12000rpm/min离心3分钟后取其上清用于检测漆酶活性，以选择漆酶表达量高的酵母重组菌株，漆酶反应体系如下：0.02mol/L醋酸‑醋酸钠缓冲液pH3.6，0.5mmol/L ABTS，20ul酵母表达上清，0.2mmol/L CuSO4，补充双蒸水至1ml，以转化的负对照为本底，在420nm处测定其在3分钟内催化底物ABTS的μmol数；F、融合蛋白的纯化将50ml上清粗酶液与10ml Ni2+离子亲和层析树脂混合，4℃缓慢摇动4‑12h，然后将混合物装柱，柱直径2mM、柱高10mM，用10倍柱床体积的PBS*(pH7.4)缓冲溶液平衡柱子，流速控制在1mL/min至1.2mL/min，当柱中平衡溶液快接近凝胶柱界面时，封住下端出口，将结合后的填料再次上柱分别用5倍柱体积的I‑40：40mM Imidazole in PBS Buffer和2倍柱体积的I‑45Buffer：45mM Imidazole in PBS Buffer洗脱，流速为自然流出，收集洗脱液，每次洗脱时，用1.5ml Eppendorf管收集，每管收集1.5ml，这一步用来除去与镍非特异性结合的杂蛋白，分别用用I‑250Buffer：250mM Imidazole in PBS Buffer洗脱，流速为自然流出，收集洗脱液，收集方法与上相同，目的蛋白在这一步从柱上被洗脱下来，最后用I‑1000Buffer：1M Imidazole in PBS Buffer洗脱，流速为自然流出，不必收集洗脱液，收集洗脱峰，目的蛋白经10％SDS‑PAGE电泳鉴定，纯化后的蛋白经65％硫酸铵沉淀浓缩后再用50mM磷酸缓冲液pH7.2透析去除残余的硫酸铵，在实验室摇瓶发酵条件下，从1L培养物中可获得50‑80mg纯蛋白；G、酶动力学参数测定使用漆酶底物ABTS(2，2’‑联氮基‑双(3‑乙基苯丙噻唑啉‑6‑磺酸))和DMP(2，6‑二甲基苯)检测，麦芽糖结合蛋白‑细菌漆酶融合蛋白具有与未融合的细菌漆酶相似的酶动力学参数，以DMP为底物时，反应体系为50mM TrisHCl pH8.0、0.2rnM CuSO4和不同浓度的DMP0.2、0.3、0.4、0.6和1mM，在反应体系中加入1‑5μl适量稀释的纯酶后启动反应，用MV‑2550型紫外分光光度计在37℃条件下测定477nm的吸收光度值；以ABTS为底物时，反应体系为50mM醋酸缓冲液pH3.0、0.2mM CuSO4和不同浓度的ABTS0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2mM，在反应体系中加入1‑5μl适量稀释的纯酶后启动反应，用MV‑2550型紫外分光光度计在37℃条件下测定420nm的吸收光度值；再根据吸收值的改变ΔA值和消光系数ε计算出单位时间内产物的生成量即酶反应速度υ，DMP在477nm处的消光系数为14.8mM‑1cm‑1，ABTS在420nm处的消光系数为36mM‑1cm‑1，酶活力定义为在37℃条件下每分钟氧化1μg底物为1个酶活力单位，然后再根据Lineweaver‑Burk双倒数作图法1/v＝(Km/Vmax)*1/[S]+1/Vmax求出酶动力学参数Km、Vmax和Km/Vmax值。