[发明专利]一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法

摘要

本发明公开了一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，包括对被检样品进行预处理，快速提取DNA；根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB-F3、HLB-B3和外侧引物HLB-FIP、HLB-BIP各一对，制备特异性引物；荧光核酸恒温扩增检测技术反应；荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建，根据不同稀释的模板pMD18-T-HLB的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间；采用定量检测结果判断，在ESE-Quant TubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。本发明灵敏度高、高特异性、低污染、反应稳定的优点。

主权项

一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法，其特征在于，该实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法步骤如下：步骤一、对被检样品进行预处理，提取DNA，取老熟叶片中脉近叶柄处5mg～10mg置于1.5mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入60μLTES缓冲液，70℃恒温水浴7min后再加入60μL酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1，涡旋混匀后12000rpm离心5min，取40μL上清液加入由SephadexG‑50‑80构成的微柱中，4℃、5000rpm离心4min，用一新的无菌1.5mL的离心管收集滤液，‑20℃保存备用；步骤二、根据HLB16SrDNA保守序列设计出2对特异性引物，包含内侧引物HLB‑F3、HLB‑B3和外侧引物HLB‑FIP、HLB‑BIP各一对，制备特异性引物；步骤三、荧光核酸恒温扩增检测反应；将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应；步骤四、荧光核酸恒温扩增检测标准曲线的构建；采用HLB亚洲种特异性PCR引物OI1和OI2c，引物扩增的的rDNA序列包含整个RealAmp的扩增区间，克隆序列到pMD18‑T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18‑T‑HLB，用于构建标准曲线；HLB的PCR检测反应体系的方法：2.5μL10×PCRbufferMg2+，2μLdNTPs（2.5mMeach），0.25μLTaq聚合酶（5U/μL），引物OI1（5′‑GCGCGTATTTTATACGAGCGGCA‑3′）和OI2c（5′‑GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT‑3′）各1μL（10pM），1μLDNA，补水至25μL；PCR反应的条件：94℃预变性3min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延长90s、进行35次循环；72℃延长7min，反应结束后，取5μL反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后EB染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接 pMD‑18‑T载体后测序正确后，将质粒命名为pMD18‑T‑HLB10ng/μL，10倍梯度稀释后作为模板用于评估荧光核酸恒温扩增的检测灵敏度并构建HLB RealAmp的标准曲线；步骤五、采用定量检测结果的判断，在ESE‑QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果，反应结束后瞬时离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果。