[发明专利]一种枣树抗病基因转化的方法

摘要

本发明涉及一种枣树抗病基因转化的方法，属于植物生物技术领域。具体步骤包括：(1)预培养受体材料；(2)制备侵染液：包括：①农杆菌菌液制备；②MS母液的制备；(3)侵染受体材料；(4)共培养；(5)抑菌及卡那霉素筛选培养；(6)分子检测。本发明采用双层培养基进行共培养，既有效保证了受体的充足营养，又克服了共培养期间因农杆菌过度繁殖对受体材料正常生长的抑制作用，并减轻了后期抑菌困难的问题；具有较高的可重复性，在一定程度上缩短了枣树遗传育种的周期，使木本植物宁阳大枣难于进行基因介导的难题和因受体材料原因导致的侵染效率低下问题得以改善，为进一步的遗传育种研究提供一种新的途径。

主权项

一种枣树抗病基因转化的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：(1)预培养受体材料；选择大枣组培苗进行取材，组培苗应生长健壮，无玻璃化及枯黄现象，高度1～3cm，贴近培养基的茎基部粗度目测高于1mm，每段茎段长度为1～1.5cm，至少保留一个芽，将剪取的茎段浅嵌于分化培养基表面，培养基厚度1～2cm，每瓶培养基体积15～20ml，每瓶培养基可放6～8个茎段；将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2～6d，培养温度25℃左右；(2)制备侵染液：包括：①农杆菌菌液制备：挑取农杆菌菌株LBA4404的单菌落接种到5ml含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液体培养基中，在温度25～30℃，震荡转速160～200rpm条件下培养12～48h，然后取1～5ml转接于100ml含有50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，在温度25～30℃、转速160～200rpm的条件下培养12～24h，菌液OD600 0.3～0.7时作为备用菌液；②MS母液的制备：本发明所用MS母液为MS培养基常用量的全量MS母液，按每升培养基常规用量配制，为包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物四类溶液的混合液，母液混匀后高压灭菌备用；(3)侵染受体材料：先将制备好的农杆菌菌液和MS母液按1/3～1/2体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.2～6.7，备用；再将已预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，再在无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理；刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15～20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触；(4)共培养：侵染结束，取出受体茎段，用无菌滤纸吸干表面多余液体，转接于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6～8个茎段放置；将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2～4d，培养温度23～28℃左右；对照组同样处理；(5)抑菌及卡那霉素筛选培养：共培养结束，将受体材料转接于含有卡那霉素(kanamycin)和抑菌素Cef(头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行，各阶段的培养基均调节为pH6.2～7.0；第一阶段卡那霉素20mg/L，抑菌素Cef(头孢霉素)400mg/L，培养6～10d；第二阶段卡那霉素40mg/L，抑 菌素Cef(头孢霉素)400mg/L，培养15～20d；第三阶段卡那霉素60mg/L，抑菌素Cef(头孢霉素)200mg/L，培养20～30d；(6)分子检测：经过上述两个阶段的Cef抑菌和卡那霉素筛选培养，20d后，受体茎段表现出明显分离生长状态，超过1/3的茎段出现由黄化至枯死的变化，约2/3茎段萌发出绿色的抗性新芽，抗性芽长度为0.5～1cm；对存活的抗性芽苗进行采样，提取抗性芽的DNA并进行PCR扩增检测，提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法，采用CcRIP II～2基因序列资料设计引物。