[发明专利]一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法

摘要

本发明公开了一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括：步骤1）酵母目标突变体的获得；步骤2）多重逆境筛选；步骤3）候选基因测序；步骤4）抗多重逆境检验。本发明根据异源功能互补、利用对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出植物cDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因。可在短时间内筛选出大量与植物多重逆境抗性相关的基因，且实验成本低、操作程序简单、稳定性好、效率高。

主权项

1.一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步骤：步骤1)酵母目标突变体的获得将酵母野生型和各种酵母突变体，接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养，转入新鲜YPD液体培养基，至分裂2代；收集处于对数生长期的细胞(OD₆₀₀＝0.4～0.6)，10倍梯度稀释5次，分别置于含0.5‑2.0mmol/L H₂O₂、20‑80mmol/L ZnCl₂、50‑250mmol/L CdCl₂、150‑350mmol/L NaCl的YPD固体培养基中培养，及分别在37℃、15℃、30℃条件下置于YPD固体培养基中培养；从中筛选出对上述逆境条件均敏感的酵母菌株突变体ΔHog1，作为文库筛选的宿主菌株；步骤2)多重逆境筛选用植物cDNA文库转化步骤1)中筛选出的突变体菌株ΔHog1得到酵母转化子，并培养于含0.25‑1.0mmol/L H₂O₂的营养缺陷型SD培养基上；挑取生长出的单克隆，培养于含0.25‑1.0mmol/L H₂O₂的营养缺陷型SD培养基上；将生长状态良好的酵母转化子分别培养于含0.25‑1.0mmol/L H₂O₂、5‑15mmol/L ZnCl₂、20‑100mmol/L CdCl₂、100‑350mmol/L NaCl的营养缺陷型SD固体培养基上，及分别在37℃、15℃、30℃条件下置于营养缺陷型SD固体培养基中培养；步骤3)候选基因测序提取在步骤2)中的逆境条件下都生长良好的酵母转化子质粒，进行测序，所得植物基因进行抗多重逆性检验；步骤4)抗多重逆性检验选取缺失步骤3)中所得多重逆境抗性基因的植物突变体，与植物野生型同时培养于含1.0‑15mmol/L H₂O₂、100‑450μmol/L ZnCl₂、50‑350mmol/L CdCl₂、50‑300mmol/L NaCl、的MS固体培养基及在37℃、15℃、22℃条件下置于MS固体培养基；如果该植物突变体的生长状态差于植物野生型，则步骤3)测序得到的植物基因即为该植物的多重逆境抗性基因。