[发明专利]一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法，包括禽流感病毒的培养、病毒灭活、病毒浓缩及疫苗乳化等步骤。与现有技术相比本发明采用了本土分离的禽流感病毒，利用MDCK细胞取代鸡胚组织繁殖病毒，降低了疫苗生产成本，质量易于实现均衡稳定，显著提高疫苗产量和质量；本发明利用均质机对疫苗进行乳化，制备的疫苗为水包油包水型，相对于传统的油包水剂型而言该疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本发明选用的佐剂在疫苗制备过程中无需额外添加任何表面活性剂成分，制备的疫苗安全性好，避免了传统油佐剂难以吸收造成的副作用。

主权项

一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）制苗用细胞的培养：取细胞培养瓶中生长良好的MDCK细胞，经EDTA‑胰酶细胞分散液消化制备细胞悬液，细胞计数后按5×105/mL‑5×106/mL的细胞密度接种于含有8%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃条件下摇瓶培养过夜；2）细胞的培养与收获：当细胞长满培养基单层时，按种毒接种量0.01‑0.5MOI、病毒含量大于等于106.5TCID50/mL的禽流感病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养48‑96小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；3）病毒的灭活：将步骤2）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5‑2‰(v/v)，充分摇匀毒液，以180r/min转速，20‑25℃条件下灭活12‑48小时；4）疫苗的制备：将灭活后的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，将滤过液用截留分子量为300KD的膜包进行2‑3倍浓缩，浓缩后的病毒液即为水相，使用前置于28‑32℃水浴锅中进行预热；取疫苗佐剂，充分混匀后置于28‑32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8‑1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1‑2h，然后采用均质机调整二级阀压力为20‑30bar、一级阀压力为400‑500bar对该混合物乳化2‑3次，即得到一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗。