[发明专利]栀子内生真菌的分离筛选方法

摘要

本发明公开了一种栀子内生真菌的分离筛选方法。该方法通过栀子组织的准备、表面消毒与无菌检测、栀子组织内生真菌的分离培养、适用于栀子内生真菌的液体发酵培养基的配制、内生真菌培养和功能菌株筛选等步骤得到真菌，为实现高纯度京尼平的大规模制备，提供了有效的菌种分离筛选方法。

主权项

一种栀子内生真菌的分离筛选方法，该方法包括以下步骤：A、栀子组织的准备：采集茜草科植物栀子的新鲜无虫害的果实和叶子；B、栀子组织的表面消毒：将步骤A栀子组织经过表面消毒，直接接种于马铃薯葡萄糖培养基平皿上，置26‑28°C恒温箱培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；C、栀子组织内生真菌的分离培养：将步骤B的无菌组织在无菌条件下切割成小片移植于马铃薯葡萄糖培养基或马丁氏培养基上，置26‑28°C恒温箱培养，至样品周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA培养基4‑10天后，得到分离纯化的内生真菌菌丝；D、内生真菌液体发酵培养基的配制：每升培养基中各组分的质量为蛋白胨0.6‑6 g，葡萄糖1‑10 g、磷酸二氢钾0.2‑2 g、硫酸镁0.2‑2 g，用纯净水定容至1L；E、内生真菌发酵培养：取步骤D液体发酵培养基100 mL加入到250 mL的培养瓶中，挑取经步骤C分离纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，同时加入3 mg纯度大于98%的京尼平苷，置26‑28°C的摇床，100‑180r/min，振荡培养5‑10天，发酵液经3000‑4500 r/min离心后，取发酵上清液备用；F、功能菌株筛选：取步骤E各上清液加入100mL正丁醇萃取数次，合并萃取液，减压回收正丁醇，用甲醇定容至5mL，经高效液相色谱检测京尼平苷和京尼平，通过两者峰面积比值计算京尼平苷和京尼平转化率；G、菌种的保存：将步骤F筛选出的具有高效转化率的内生真菌菌株置于液体马丁氏培养基与甘油的体积比为3:1进行保藏。