[发明专利]驼乳中重链抗体的分离纯化及鉴定

摘要

本发明涉及一种从双峰驼乳中筛选纯化及鉴定重链抗体的方法，并测定了重链抗体约占乳清IgG的含量。该方法包括如下步骤：首先采用低温高速离心的方法分离乳清；然后再采用亲和层析从乳清中纯化免疫球蛋白G，得到纯化后的IgG1，IgG2和IgG3。在得到纯化后的IgG后，通过SDS-PAGE电泳检测纯化后的总IgG的纯度，通过BCA法和ELISA法测定总蛋白和IgG1，IgG2，IgG3的含量，最终确认制备得到的纯化后的IgG1为常规四聚体抗体，IgG2和IgG3亚型为二聚体抗体，即为重链抗体（heavychain antibodies，HCAb）。

主权项

一种从双峰驼乳中筛选纯化重链抗体的方法，其特征在于该方法步骤包括：（1）用0.02M pH7.4的PBS结合缓冲液平衡protein A/G柱子，至仪器的各条基线都平后，将过滤后的乳清以PBS结合缓冲液5倍稀释，上样至Protein G层析柱，结合10min，收集流穿液；（2）用20倍柱床体积的0.02M的pH7.4的PBS结合缓冲液洗涤层析柱后，分别以洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C先后洗脱IgG1及IgG3，洗脱后立即用中和缓冲液调节洗脱液pH值至7.4，并以结合缓冲液将层析柱洗涤至中性，洗脱流速2mL/min，其中洗脱缓冲液B为含0.58%乙酸的pH3.5的0.15mol·L‑1NaCl，洗脱缓冲液C为pH2.7的0.1mol·L‑1甘氨酸，中和缓冲液为pH9.0的1mol·L‑1Tris‑HCL；（3）将收集的Protein G层析柱流穿液，上样至Protein A层析柱，10倍柱体积结合缓冲液洗涤层析柱去除杂蛋白，以洗脱缓冲液D洗脱IgG2亚型重链抗体，立即中和洗脱液至pH值达7.4，并以结合缓冲液将层析柱洗涤至中性，洗脱流速1.5mL/min，洗脱缓冲液D为pH2.0的0.1mol·L‑1甘氨酸；（4）用截留分子量为30kDa的超滤离心管，浓缩蛋白并除盐，超滤浓缩40‑50倍；制备得到纯化的IgG1、IgG2和IgG3，其中纯化后的IgG1为常规四聚体抗体，IgG2和IgG3亚型为二聚体抗体，即为重链抗体。