[发明专利]一种筛选细菌新菌种的方法

摘要

本发明提供了一种筛选细菌新菌种的方法，其步骤如下：（1）富集培养样品中的细菌并对其进行分离纯化；（2）PCR纯化产物的16S rDNA、克隆、测序；（3）筛出与NCBI数据库中16SrDNA序列同源性低于97%的序列；（4）PCR含有目标菌种16S rDNA序列克隆子16S rDNA可变区；（5）再次纯化含目标菌种的菌液，PCR其16S rDNA可变区；（6）对步骤（5）中16S rDNA可变区样品进行变性梯度凝胶电泳，以步骤（4）中PCR产物为标记物，筛出含有目标菌种且电泳条带最少的纯化产物；（7）以步骤（6）中筛选出的纯化产物为基础，重复步骤（5）、（6）的操作，直到获得纯化的新菌种。

主权项

一种筛选细菌新菌种的方法，其特征在于步骤如下：（1）富集培养样品中的细菌并对其进行分离纯化，得到第一代纯化产物；（2）提取、纯化步骤（1）中每一个第一代纯化产物的总DNA，然后PCR扩增其16S rDNA，将所得总16S rDNA插入到原核载体中构建原核重组质粒，然后将原核重组质粒转化至感受态细胞中培养，筛选出阳性克隆子，提取阳性克隆子质粒，并对其进行酶切分析，将酶切图谱相同的归为同一个分类操作单位，从每个分类操作单位中取1～2个克隆子的质粒进行测序；（3）分别将步骤（2）中测得的16S rDNA序列与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行比对，筛选出与NCBI数据库中的16S rDNA序列同源性低于97%的序列，即目标菌种16SrDNA序列；（4）取含有目标菌种16S rDNA序列的克隆子，提取其质粒，PCR扩增质粒中的16S rDNA可变区，并将PCR扩增产物保存备用；（5）将含目标菌种的第一代纯化产物进一步分离纯化，得第二代纯化产物，PCR扩增每一个第二代纯化产物的16S rDNA可变区；（6）分别对步骤（5）获得的16S rDNA可变区样品进行变性梯度凝胶电泳，以步骤（4）所得PCR扩增产物为标记物，筛选出含有目标菌种且电泳条带最少的第二代纯化产物；（7）以步骤（6）中筛选出的纯化产物为基础，重复步骤（5）、（6）的操作对所述纯化产物进行进一步的分离纯化，直到16S rDNA可变区样品的电泳条带中只含有与标记物的电泳条带位置一致的电泳条带，即筛选得到纯化的新菌种。