[发明专利]一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法。该方法包括木薯叶片中蔗糖合成酶合成方向与分解方向酶活性的测定，用新鲜木薯叶片提取酶液后，通过透析袋脱糖，再测定酶活性。与现有方法相比，本发明采用酶液提取后进行透析脱糖处理与酶活性测定技术相结合，能够有效消除木薯叶片酶提取液中高本底蔗糖含量对蔗糖合成酶酶活性测定的干扰，提高测定灵敏度，测定过程易于控制，测定结果可靠、可比性强、重现性好。

主权项

一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法，其特征在于，该方法包括木薯叶片中蔗糖合成酶合成方向与分解方向酶活性的测定，用新鲜木薯叶片提取酶液后，通过透析袋脱糖，再测定酶活性，具体操作步骤如下：1）材料采集与保存：采集新鲜的木薯叶片，迅速放入低温容器中，如果不能马上进行测定，则用液氮研磨后置于－80℃低温冰箱中保存待用；2）酶液提取：取1g左右预冷的木薯叶片，加少量石英砂和5mL酶液提取缓冲液，其组成为：100mmol／L，pH=7.2的Tris‑HCl、10mmol／L MgCl2、1mmol／L EDTA‑Na2、10mmol／Lβ‑巯基乙醇、体积浓度2％乙二醇、重量浓度l％聚乙烯吡咯烷酮，于研钵中快速研磨成均匀糊状，洗净研钵后，倒入离心管中，在低温冷冻超速离心机上12000r／min离心15min，取上清液，弃沉淀,以上提取过程均在4℃下进行；3）酶液透析脱糖：取上清液2.5mL装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中过夜，透析缓冲液组成为：20mmol／L、pH=7.2的Tris‑HCl，2.5mmol／L MgCl2，1mmol／L EDTA‑Na2，5mmol／Lβ‑巯基乙醇，体积浓度1％乙二醇，期间更换透析缓冲液1次，每次用125mL以上；透析过程在4℃下进行，透析后酶液用于酶活性测定；4)蔗糖合成酶合成方向的酶活性测定：每一处理取4只试管，其中1个作为空白对照，3个作为测定重复，各加入0.2mL上述透析脱糖后酶液，此时空白对照管加入0.2mL2mmol／L NaOH灭酶活，然后在上述4只试管中加入0.4mL合成反应介质，其组成为：100mmol／L pH=7.2的Tris—HCl、10mmol／L MgCl2、5mmol／L UDPG、10mmol／L D－果糖，于30℃水浴反应30min后，沸水浴5min， 加0.2mL2mol／L NaOH混匀，再沸水浴10min，冷却，加入1mL重量浓度0.1％间苯二酚和3.5mL重量浓度30％HCl，摇匀，80℃水浴l0min，冷却，480nm处比色；从蔗糖标准曲线计算出酶活性，用微摩尔蔗糖／克鲜重·小时，即μmol蔗糖／gFW·h表示；5）蔗糖标准曲线的绘制：精确称取0.1000g蔗糖用超纯水溶解、定容至250ml，配制成400μg/mL蔗糖溶液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL上述蔗糖溶液于试管中，不足0.6mL的用超纯水补至0.6mL，加0.2mL2mol／L NaOH并混匀，加入1mL重量浓度0.1％间苯二酚和3.5mL重量浓度30％HCl，摇匀，80℃水浴l0min，冷却，480nm处比色，以不同浓度的蔗糖测得的结果绘制蔗糖标准曲线；6）蔗糖合成酶分解方向酶活性的测定：每一处理取4支试管，其中1个作为空白对照，3个作为测定重复，各加入0.2mL上述透析脱糖后酶液，此时空白对照管加入0.2mL2mol／L NaOH灭酶活，然后在4只试管加0.4mL合成反应介质，其组成为：100mmol／L pH=7.2的Tris—HCl、10mmol／L MgCl2，5mmol／L UDP、50mmol／L蔗糖，于30℃水浴反应30min后，沸水浴5min，加0.1mL2mol／L NaOH混匀，加0.5mL DNS试剂，再沸水浴5min，冷却，再加4mL蒸馏水，在540nm处比色，从葡萄糖标准曲线计算出酶活性，酶活性用微摩尔葡萄糖／克鲜重·小时，即μmol葡萄糖／gFW·h；7）葡萄糖标准曲线的绘制：精确称取0.1000g分析纯葡萄糖，用超纯水溶解、定容至500mL，配制成200μg/mL葡萄糖溶液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL上述葡萄糖溶液于试管中，不足0.6mL的用超纯水补至0.6mL，加0.2mL2mol／L NaOH混匀，加0.5mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却，再加4mL超纯水，在540nm处比色，以不同浓度的葡萄糖测得的结果绘制葡萄糖标 准曲线；上述步骤3）酶液透析脱糖：所述的透析袋是指截留分子量在3500～14000Dalton以上的用半透膜做成能装入待透析液体的袋或管。