[发明专利]一种基于磁分离-量子点免疫荧光传感检测生物大分子的方法及其试剂制备方法

摘要

一种基于磁分离-量子点免疫荧光间接检测生物大分子的方法及其试剂制备方法，其特征在于，用超顺纳米磁珠MBs为载体与抗待测生物大分子的抗体Ab1偶联而制得捕获抗体MB-Ab1；将量子点与抗待测生物大分子的抗体Ab2偶联而制得量子点荧光探针QDs-Ab2；用MB-Ab1从试样中富集待测生物大分子Ag，制得系列复合物MB-Ab1-Ag；使MB-Ab1-Ag与QDs-Ab2反应形成MB-Ab1-Ag-Ab2-QDs，经磁分离使之与液相QDs-Ab2免疫荧光探针分离；测量液相中QDs-Ab2荧光强度X，利用待测生物大分子浓度C与X之间呈现的反相关关系而间接测得C；该方法操作简便，稳定性好，检测灵敏度高。

主权项

一种基于磁分离‑量子点免疫荧光传感检测生物大分子的方法，其特征在于，用超顺纳米磁珠MBs为载体经功能化修饰后与抗待测生物大分子的抗体Ab1偶联而制得捕获抗体MB‑Ab1；将量子点经功能化修饰后与抗待测生物大分子的抗体Ab2偶联而制得量子点荧光探针QDs‑Ab2；利用MB‑Ab1从试样中特异性富集待测生物大分子Ag，制得系列复合物MB‑Ab1‑Ag；使MB‑Ab1‑Ag与QDs‑Ab2反应形成MB‑Ab1‑Ag‑Ab2‑QDs，经磁分离使之与液相QDs‑Ab2免疫荧光探针分离；测量QDs‑Ab2荧光强度X，利用待测生物大分子浓度C与X之间呈现的反相关函数关系而实现传感检测待测生物大分子浓度；其步骤为， (1)超顺纳米磁珠MBs与抗体Ab1的偶联： a.超顺纳米磁珠的活化：取1‑5mg颗粒直径为100‑2000nm、具有羧基的超顺纳米磁珠于1.5mL离心管中，通过磁分离，去掉上清液得到超顺纳米磁珠，加入100‑1000μL磷酸盐缓冲溶液，置于超声波清洗器中超声30s后放入涡旋振荡器中振荡10s，加入5‑20μL浓度为50mg/mL的N‑羟基硫代琥珀酰亚胺NHS和5‑20μL浓度为50mg/mL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，摇振20min；通过磁分离，去掉剩余的活化剂和副产物，再用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤，洗涤2‑3次，再溶于100‑1000μL上述PBS缓冲溶液，得到活化的超顺纳米磁珠悬浮液。 b.抗体与活化的超顺纳米磁珠的偶联：取80‑100μL上述活化纳米磁珠悬浮液于离心管中，加入蛋白含量为5‑10mg/mL的Ab1抗体0.3‑0.5mg，摇振0.5‑2h，通过磁分离去掉未反应物，再将磁珠溶于500‑1000μL上述封闭液，反应半小时，再通过磁分离去掉上清液，加入200‑1000μL洗涤液PBST重新溶解，在涡旋振荡器中振荡30s再进行磁分离，该洗涤步骤重复2次，再用1000μL的PBS溶液复溶，得到磁免疫亲和富集试剂MB‑Ab1，保存于4℃冰箱中。 (2)量子点QDs与抗待测生物大分子的抗体Ab2的偶联： a.量子点QDs的活化：取200‑500μL表面修饰有羧基的量子点加入到1.5mL离心管中，置于超声波清洗器中超声30s后放入涡旋振荡器中振荡10s，再加入10‑50μL质量浓度为5 mg/mL的NHS和10‑50μL浓度为10mg/mL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，摇振10‑20min进行活化。 b.抗生物大分子抗体Ab2与QDs的偶联：将为蛋白含量5‑10mg/mL的Ab2抗体0.2‑0.3mg加入到上述活化好的QDs悬浮液中，摇振0.5‑2h，加入500‑1000μL上述封闭液反应0.5h，用分子量为100kd的超滤离心管在离心力为8000g下离心15min，去掉下清液，用100‑500μL的PBS溶液重溶QDs‑Ab2，用分子量为100kd的超滤离心管在离心力为8000g下离心15min，该步骤重复2‑3次，最后用100‑500μL的PBS溶液复溶QDs‑Ab2，制得QDs‑Ab2荧光免疫探针。 (3)试样中待测生物大分子Ag的富集： a.亲和富集：取100μL上述MB‑Ab1溶液分别与1000μL不同浓度的待测生物大分子Ag混合于1.5mL离心管中，室温下涡旋10‑15min，经磁分离后用100μL上述磷酸盐缓冲溶液复溶，制得系列复合物MB‑Ab1‑Ag。 (4)微孔板荧光检测仪间接检测试样中待测生物大分子含量： a.免疫反应：分别取上述系列MB‑Ab1‑Ag复合物100μL于96孔细胞培养板中，分别加入100μL上述QDs‑Ab2荧光免疫探针，于37℃下反应15min，经磁分离，使MB‑Ab1‑Ag‑Ab2‑QDs免疫复合物与液相QDs‑Ab2免疫荧光探针分离。 b.免疫荧光定量分析：利用多功能荧光酶标仪分别对液相QDs‑Ab2免疫荧光探针进行荧光测定，其荧光强度X与待测生物大分子浓度C符合下列函数关系式，从而间接测得了待测生物大分子浓度。 Lg[C]＝AX+B C：待测物的浓度； X：测得量子点荧光强度； A和B均为常数。