[发明专利]通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法

摘要

本发明涉及一种通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，利用ZEN毒素苯环结构上羟基所具有的酸性，从接种禾谷镰刀菌的麦粒培养基中提取含有ZEN毒素的粗提液，其特征在于：将含有ZEN毒素的粗提液通过氢氧化钠过量碱化，使ZEN毒素溶解于水中，与有机溶剂分离；通过酸化调节含有ZEN毒素的水相至pH2.0~7.0，恢复结构，加入有机试剂使ZEN毒素重新溶解于有机试剂中，与水相分离，浓缩有机试剂得到ZEN粗毒素；采用制备型液相色谱对ZEN毒素在液相色谱上的紫外吸收峰进行回收，获得制备的ZEN毒素。

主权项

一种通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，利用ZEN毒素苯环结构上羟基所具有的酸性，从接种禾谷镰刀菌的麦粒培养基中提取含有ZEN毒素的粗提液，其特征在于：将含有ZEN毒素的粗提液加入过量的氢氧化钠碱化，使ZEN毒素溶解于水中，与有机溶剂分离；通过酸化调节含有ZEN毒素的水相至pH2.0~7.0，恢复结构，加入有机试剂使ZEN毒素重新溶解于有机试剂中，与水相分离，浓缩有机试剂得到ZEN粗毒素；采用制备型液相色谱对ZEN毒素在液相色谱上的紫外吸收峰进行回收，获得制备的ZEN毒素，具体的步骤是：a) 将禾谷镰刀菌活化后接到绿豆汤液体培养基中，28℃摇床振荡培养5天后用灭菌纱布过滤得到禾谷镰刀菌孢子液，孢子液浓度为1×107 个/ml ，取2ml孢子液接到200g麦粒培养基中，28℃光培养25天，获得含有ZEN毒素的培养物；b) 称取100g含有ZEN毒素的培养物，加入500ml体积比80:20的乙腈/水提取液，摇床室温振荡30分钟，离心后收集含有ZEN毒素的粗提液；c) 将含有ZEN毒素的粗提液旋转蒸干后加入20ml色谱纯甲醇重新溶解，取2ml用于粗提液的检测，重新蒸干剩余粗提液后加入50ml体积比1:1的三氯甲烷/水溶液重新溶解，加入过量的氢氧化钠固体，直到氢氧化钠不能溶解为止，混匀分层后取上层提取物；d) 将c步骤上层提取物装入试管，然后加入盐酸酸化，调节至pH2.0~7.0后加入等体积的三氯甲烷，混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在色谱纯的甲醇中，采用高效液相色谱检测pH2.0~7.0条件下ZEN毒素含量；高效液相色谱检测条件为：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波长λ=236nm，流动相中甲醇与水的体积比为80:20，利用制备型液相色谱的馏分收集器收集在8.00‑8.70 min之间含有ZEN毒素的流动相，获得纯化的ZEN毒素；所述的绿豆汤培养基为：准确称取绿豆3g，加入100ml单蒸水，电磁炉加热至绿豆表皮开始破裂，纱布过滤后定容至100ml，装入250ml三角瓶，121℃灭菌30分钟；所述的麦粒培养基为：将麦粒经单蒸水浸泡过夜后，去除单蒸水将湿麦粒装入灭菌袋中，121℃灭菌30分钟。