[发明专利]一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法

摘要

本发明提供一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，包括以下步骤：（1）PUMA-/-(PUMA基因敲除)小鼠或PUMA-/+小鼠成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；（3）逆转录病毒的包装、滴度测定与冻存；（4）PUMA基因敲除小鼠或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程；（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程。本发明的有益效果是通过在体细胞重编程步骤中抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效，同时能够保护iPS细胞基因组稳定性。

主权项

一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）PUMA‑/‑(PUMA基因敲除)或PUMA‑/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX‑Oct4、PMX‑Sox2、PMX‑c‑Myc和PMX‑KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；（3）逆转录病毒载体的包装、滴度测定与冻存：将携带有PMX‑Oct4、PMX‑Sox2、PMX‑c‑Myc和PMX‑KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat‑E细胞中，回收在培养上清液中产生的逆转录病毒载体，并进行滴度测定与冻存；（4）PUMA‑/‑或PUMA‑/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程将步骤（3）中的携带有PMX‑Oct4、PMX‑Sox2、PMX‑c‑Myc和PMX‑KLF44个转录因子的逆转录病毒载体感染步骤（1）得到的PUMA‑/‑或PUMA‑/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并用饲养层细胞支持培养感染的PUMA‑/‑或PUMA‑/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，连续培养，出现的克隆为PUMA‑/‑或PUMA‑/+小鼠iPS细胞；（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程将人PUMA shRNA（载体Plk0.1）和携带有人PMX‑Oct4、PMX‑Sox2、PMX‑c‑Myc和PMX‑KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat‑E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，并用饲养层细胞支持培养感染的人成纤维细胞，培养7天后，用条件培养基培养，连续培养，出现的克隆为敲降PUMA功能的人iPS细胞。