[发明专利]一种快速检测番木瓜环斑病毒胶体金免疫试纸条

摘要

本发明涉及一种快速检测番木瓜环斑病毒（PRSV）免疫胶体金试纸条的制备与应用，以繁殖于西葫芦上的PRSV-Vb为材料，以纯化的PRSV为抗原制备多克隆抗体，多克隆抗体经胶体金标记后为金标抗体。先将多克隆抗体和羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，金标抗体包被在玻璃纤维素膜制成的结合垫上，再将包被多克隆抗体和羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜粘贴于PVC底板上，最后于检测线端依次粘贴金标结合垫和玻璃钎维素制成的样品垫，质控线端粘贴吸水纸，制成PRSV胶体金免疫试纸条。本发明具有操作简单，检测速度快，无需特殊的仪器设备，检测结果准确可靠，成本低廉，可用于田间病株的早期诊断。

主权项

一种检测番木瓜环斑病毒免疫胶体金试纸条，其特征在于制备方法包括下述步骤：1)      PRSV的提纯：将PRSV‑Vb株系摩擦接种于系统感染寄主西葫芦上，以出现典型症状的西葫芦叶片为提纯PRSV的材料进行提纯，得提纯的番木瓜环斑病毒；2)      多克隆抗体的制备：以步骤1）提纯的PRSV为抗原，弗氏佐剂为乳化剂，按常规方法免疫新西兰大白兔，制备抗PRSV的多克隆抗体；3)      多克隆抗体纯化：对步骤2)所制备的抗PRSV多克隆抗体进行纯化；4)      胶体金溶液的制备：按100 mL 0.01% w/v的四氯金酸溶液用1.5 mL–3 mL的1% w/v柠檬酸钠溶液还原的比例制备胶体金溶液，溶液搅拌煮沸15 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于4℃条件下保存；5)      PRSV金标抗体的制备：取100 mL步骤4）制备的胶体金溶液，用0.1M K2CO3调节胶体金溶液pH值至7.2–8.0，然后边搅拌边加入1.5 mg–2 mg步骤3）纯化的抗体，搅拌混匀，加入5% w/v牛血清蛋白进行封闭，加入量为使牛血清蛋白终浓度为1% w/v；封闭后的溶液于250×g离心20 min–30 min，弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，上清液于14000×g离心40 min–60 min，弃去上清液，沉淀加悬浮缓冲液至100 mL进行悬浮；悬浮缓冲液为：含1% w/vBSA和0.02% w/v NaN3的0.01 M pH 7.2‑8.0磷酸盐缓冲液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后的滤液于4℃下保存；悬浮后的溶液重复高速离心一次，弃去上清液，沉淀再用上述同样的悬浮缓冲液混悬至10 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为PRSV金标抗体溶液，4℃条件下保存；6)      PRSV金标抗体结合垫的制备：将裁剪好的4 mm×6 mm玻璃纤维素膜预先浸泡在PRSV金标抗体结合垫封闭缓冲液中30 min，37℃干燥30‑60 min；取稀释后的金标抗体溶液10–20 μL混匀液喷涂于上述预处理好的玻璃纤维素膜上，37℃干燥30 min–2 h，制成PRSV金标抗体结合垫；其中所述的PRSV金标抗体结合垫封闭缓冲液的配制：0.2% w/v BSA，0.5%V/V Tween–20，0.01 M pH 7.2–8.0磷酸盐缓冲液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于4℃条件下保存；所述的稀释后的金标抗体溶液的配制：取步骤 5）制备的PRSV金标抗体溶液1 mL，加PRSV金标抗体稀释缓冲液1 mL–3 mL混匀；所述PRSV金标抗体稀释缓冲液的制备为1% w/v BSA，2.5% w/v蔗糖，0.01 M pH 7.2–8.0磷酸盐缓冲液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于4℃条件下保存；7)      检测线与质控线的制作：将步骤3）纯化后的抗体用0.01 M pH 8.0磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1.6 –2.0 mg/mL，羊抗兔IgG用0.01 M pH 8.0磷酸盐缓冲液稀释至浓度为0.5 –0.6 mg/mL，然后将稀释后的PRSV抗体和羊抗兔IgG以2.5 μL/cm分别点在硝酸纤维素膜检测线和质控线上，两线相隔5 mm，37℃干燥30–60 min；将干燥后的硝酸纤维素膜浸泡在硝酸纤维素膜封闭缓冲液中，37℃孵育1 –2 h，取出后，用0.01M pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次，室温晾干；硝酸纤维素膜封闭缓冲液的配制：0.5%W/V PVP、0.5%V/V Tween–20，0.01 M pH 7.2–8.0磷酸盐缓冲液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于4℃条件下保存；8)      先将步骤7）处理的硝酸纤维素膜粘贴于PVC底板的中间位置上，然后往PVC的一端依次粘贴PRSV金标抗体结合垫和玻璃纤维素膜制成的样品垫，另一端贴粘贴吸水纸作为质控线端；9）将步骤8）制备的试纸条干燥后即为番木瓜环斑病毒的免疫胶体金试纸条，用铝箔密封，4℃保存。