[发明专利]一种具备钙通道抑制功能的动物活性肽的鉴定方法

摘要

本发明涉及一种具备哺乳动物N-型钙通道抑制功能的活性多肽-蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的鉴定方法。该活性多肽纯化冻干粉为类白色疏松体，极易溶解于水，无气味，水溶液近于无色透明；通过大鼠输精管实验鉴定SPAP-XVI的组织水平生物学活性，发现SPAP-XVI能快速和可逆地抑制低频率电刺激诱导的大鼠输精管收缩，抑制呈浓度依赖性，它的半数有效抑制浓度（IC₅₀）是85±6nM；通过膜片钳电生理实验鉴定SPAP-XVI对钙通道的影响，发现SPAP-XVI抑制大鼠DRG神经元N-型钙通道具有浓度依赖性和时间依赖性，它的IC₅₀值是60±5nM；10µMSPAP-XVI能够迅速抑制N-型电流(τ_on～28.3±2.3s)。SPAP-XVI能够抑制大鼠DRG神经元上GVIA敏感的N-型钙通道，它的低毒性和可逆性使之有希望成为开发治疗N-型钙通道相关疾病的模板分子。

主权项

本发明旨在于提供一种从蜘蛛毒液中鉴定哺乳动物N‑型钙通道抑制剂蜘蛛抑痛肽‑XVI（SPAP‑XVI）的方法，其特征在于：（1）大鼠输精管实验研究SPAP‑XVI 的组织水平生物学活性：大鼠处死后立即取出长约2厘米的输精管，并置于预先用95% O₂/5% CO₂ 饱和的克氏液，轻柔的挤出输精管的内容物；将输精管的两端分别与34ºC恒温的浴槽的底部和换能器相连接，立即将标本置于浴槽中，通过分布于浴槽两端的电极向输精管施加脉冲电场刺激（波宽:0.14 ms，强度：100 V，周期：15 s）诱导输精管收缩；平衡30 min 后进行SPAP‑XVI的药理学试验；（2）膜片钳电生理活性实验检测SPAP‑XVI对电压门控钙通道的影响：①急性分离和原代培养大鼠背根神经节细胞用于膜片钳电生理活性实验：SD大白鼠处死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量细胞培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交汇处的背根神经纤维；在胸腰椎段，可挑选16个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中；在解剖显微镜下，用维娜斯剪和尖头镊子分离出神经节；剥离包在节外的絮状物和轴索后，放入盛有约0.5 mL培养液的培养皿中；用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎；剪碎之后，转入消化液，在34℃、震荡频率110 rpm的环境中进行酶解消化反应20 min；期间每隔10 min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入酶的抑制剂，终止酶解处理过程；无菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心（800 rpm、5 min），去上清，加入8 mL含10%小牛血清的长期培养液；重悬细胞后分成3～4皿，放入培养箱（5%CO₂、95%空气）中，37℃培养3～4 h贴壁；②膜片钳电生理活性实验：膜片钳实验要在室温条件下进行，采用全细胞膜片钳技术；挑选质膜光滑可见、胞质均匀的DRG细胞作为实验细胞；电流记录通过全细胞膜片钳技术利用放大器EPC9在电脑上进行；玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管；玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪抛光后电极尖端直径约为3 mm，充灌电极液后电极电阻为1‑3 MΩ；实验细胞形成全细胞记录模式后稳定4～6 min；记录电流经EPC‑9放大器10 kHz 滤波过滤；线性漏电流和电容电流用p/4程序予以删除, 数据和图形用pulsefit + pulse 8.0 软件采集分析；实验结果用Sigmaplot9.0软件进行分析。