[发明专利]一种蜡蚧菌海藻糖酶纯化的方法

摘要

本发明涉及真菌酶的分离纯化方法。更具体地，本发明涉及一种蜡蚧菌海藻糖酶的分离纯化方法。所述分离纯化方法包括硫酸铵沉淀、DEAE-52阴离子交换柱层析、SephadexG-100凝胶过滤层析。该方法将蜡蚧轮枝菌在优化后的产酶培养基中发酵培养，采用硫酸铵沉淀、DEAE-52阴离子交换柱层析、SephadexG-100凝胶过滤层析等步骤获得了凝胶电泳均一的轮枝菌海藻糖酶。本发明的分离纯化方法具有特异性高，工艺简单，易于控制；蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低等优点，具有很好的推广应用价值。

主权项

一种蜡蚧轮枝菌海藻糖酶分离纯化的方法，其特征在于包含以下步骤：(a) 粗酶液的制备: 将蜡蚧轮枝菌L. lecanii FJ28发酵液，至少每天都测定发酵液的酶活性，当发酵液中海藻糖酶活性达最高时取发酵液离心，上清液用真空抽滤，收集滤液；向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为70% wt，4℃静置过夜；再次离心收集沉淀，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解沉淀；离心溶解液除去不溶物体，上清液装于透析袋，经0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析后，再用聚乙二醇 PEG20000浓缩得到粗酶液；（b） 粗酶液经过PEG20000浓缩后，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡过夜，上样于充分平衡后的DEAE‑52 阴离子交换层析柱，再用含0‑1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液进行盐离子梯度洗脱，即可根据DEAE‑52图上的峰值收集具有酶活的洗脱液；（c） 用0.02mol/L磷酸盐缓冲液充分平衡Sephadex G‑100凝胶层析柱，将b中所得样用PEG20000浓缩上于其中后，再用0.02mol/L磷酸盐缓冲液的缓冲液进行洗脱；收集收集具有酶活的洗脱液；步骤 （a）、（b）、（c）中缓冲液为磷酸盐缓冲液为0.02mol/L pH=6.5，含0‑1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液为0.02mol/L pH=6.5。