[发明专利]一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法

摘要

本发明公开了一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法，步骤包括金银花无菌苗的获得及培养、金银花茎段的预培养、含植物表达载体的农杆菌菌株的制备、农杆菌菌液活化及农杆菌侵染液制备、农杆菌侵染和共培养、农杆菌脱菌及诱导不定芽再生、金银花小芽的分割及生根、抗生素阳性苗的筛选、抗生素阳性苗的移栽及DNA提取、转基因植株的获得。本发明方法具有不定芽再生速度快，转化周期短，转基因植株获得率高，操作简单的特点，且以茎段为外植体诱导不定芽可以避免愈伤组织培养中引起的不良变异，同时也适合多个金银花品种的不定芽发生体系，有望成为用于金银花转基因育种的可靠体系。

主权项

一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法，步骤是：金银花无菌苗的获得及培养、金银花茎段的预培养、含植物表达载体的农杆菌菌株的制备、农杆菌菌液活化及农杆菌侵染液制备、农杆菌侵染和共培养、农杆菌脱菌及诱导不定芽再生、金银花小芽的分割及生根、抗生素阳性苗的筛选、抗生素阳性苗的移栽及DNA提取、转基因植株的获得；其特征在于：所述以金银花茎段预培养的方法是:将培养20‑30天的金银花无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5‑1厘米的小段，每段含1‑2个节，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽，再将经过上述处理的金银花茎段切面向下置于预培养固体培养基上，22℃‑25℃下暗培养3‑4天，备用；其中，上述预培养固体培养基配方为：MS+0.1‑1.0mg/L NAA+25‑30g/L蔗糖+7‑8g/L琼脂，pH5.8；所述含植物表达载体的农杆菌菌株的制备方法是：选择AGL104农杆菌为转化菌株制备农杆菌感受态细胞，在50μl农杆菌感受态细胞中加入含35S::C3’H过表达载体的质粒3ul，之后冰浴30±5分钟；放入液氮中1‑5分钟，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5‑8分钟；再加入800ulYEP，28±2℃、200‑220rpm振荡培养3‑4小时；取出菌液涂布于含利福平及壮观霉素的固体YEP平板上，置28℃条件下倒置培养2‑3天，待菌落大小可见后取菌体进行菌体PCR验证，对验证正确的菌体保存至4℃，备用；其中，上述35S::C3’H过表达载体构建的方法是：将在金银花中克隆得到的C3’H基因，应用Gateway技术通过BP反应构建pDONR‑C3’H入门载体，而后通过LR反应置换至pB2GW7载体上，获得35S::C3’H过表达载体；所述农杆菌菌液活化及农杆菌侵染液制备的方法是：将制备的带有35S::C3’H过表达载体的农杆菌在添加了利福平及壮观霉素的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗条件下培养2‑3天后挑取单菌落，接入到含有利福平及壮观霉素的YEP液体培养基，28±2℃、200‑220rpm振荡培养24小时后再次转接，再在黑暗条件下28±2℃、200‑220rpm振荡培养16小时；将培养后的菌液置于灭菌的离心管中，6000rpm离心5分钟收集菌体，用5%蔗糖溶液重悬菌体，调整至OD600值为0.6‑1.0，得到农杆菌侵染液；所述农杆菌侵染和共培养的方法是：将上述暗培养后的金银花茎段在农杆菌侵染液中侵染10‑15分钟，而后用无菌滤纸吸去菌液，切面朝下置于共培养培养基上，在黑暗条件下23℃‑25℃培养3‑4天；其中，上述共培养培养基配方为：MS+0.1‑1.0mg/L NAA+25‑30g/L蔗糖+7‑8g/L琼脂，pH5.8；所述农杆菌脱菌及诱导不定芽再生的方法是：将上述共培养后的金银花茎段用无菌水清洗3‑4次，再用无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上，在23℃‑25℃、且每日光照14±2小时条件下，连续培养20±2天，分化出不定芽；其中，上述不定芽诱导培养基配方为:MS+0.1‑1.0mg/L KT+0.01‑0.1mg/L NAA+20‑30g/L蔗糖+7‑8g/L琼脂，并添加200‑300mg/L头孢噻肟钠，pH5.8；所述金银花小芽的分割及生根的方法是：当金银花茎段上诱导再生的不定芽长至1厘米时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上，在23℃‑25℃、且每日光照14±2小时条件下，培养14±1天，促使生根；其中，上述生根培养基配方为：MS+0.1‑1.0mg/L IAA+20‑30g/L蔗糖+7‑8g/L琼脂，并添加200‑300mg/L头孢噻肟钠，pH5.8；所述抗生素阳性苗的筛选的方法是：将已生出1‑2厘米根的金银花小苗不伤及根部取出，转接到含抗生素Bar的筛选培养基上，在23℃‑25℃、且每日光照14±2小时条件下，培养14±1天，存活苗即为抗生素阳性苗；其中，上述抗生素筛选培养基配方为：MS+0.1‑1.0mg/L NAA+20‑30g/L蔗糖+7‑8g/L琼脂，并添加200‑300mg/L头孢噻肟钠和25‑30mg/L Bar，pH5.8。