[发明专利]一种获得异种克隆牦牛优良胚胎的方法

摘要

本发明公开了一种异种克隆牦牛胚胎的制备及体外培养的方法，本发明方法以牦牛的乳腺细胞作为供体细胞，以黄牛或奶牛的去核卵母细胞作为受体胞质，以体细胞核移植技术构建牦牛-牛异种克隆胚胎，采用电激活-化学激活-再次电激活的激活方式，以及自制的序贯培养体系，获得了高效率、高活力的牦牛-牛异种克隆胚胎。利用本发明方法可加快牦牛繁殖的速度、缩短牦牛的繁殖周期、降低牦牛的生产成本、提高牦牛的繁殖效率，同时在一定程度上可减轻草原的破坏程度和有效的保护牦牛的种质资源。此外，本发明对于促进异种克隆牦牛、转基因克隆牦牛胚胎以及核质互作的研究具有重要意义。

主权项

一种获得异种克隆牦牛优良胚胎的方法，从新鲜的牛卵巢中采集卵母细胞为受体细胞，采集成年母牦牛的乳腺组织，培养的乳腺上皮细胞作为供核细胞，将供核细胞直接注射到去核的卵母细胞卵周隙中，形成重构胚，所述重构胚经激活和体外培养后获得异种克隆牦牛胚胎；其特征在于，包括如下步骤：(1)所述重构胚的激活包括将重构胚进行电激活、化学激活和再次电激活，即：先在电激活液中进行200V/mm、15μs、脉冲2次、每次间隔0.1s的电激活；电激活2h后，将胚胎依次移入含5μmol/L的离子霉素中4min、2mmol/L的6‑DMAP中2h的化学辅助激活；化学激活30min后，再次在电激活液中，使用直流电100V/mm、15μs、脉冲1次；(2)激活后的重构胚置于序贯培养体系中培养，在预平衡的胚胎培养液S1微滴中培养，3天后转入预平衡的胚胎培养液S2微滴中培养至第7～8天，微滴大小为120μL，每个微滴放入20枚胚胎；其中胚胎培养液S1是基础培养液BCM中添加乳酸钠1.5%、丙酮酸钠0.1g/L；胚胎培养液S2的组成成分是基础培养液BCM中添加D‑葡萄糖0.6g/L。