[发明专利]表达铁纳米颗粒以及温度敏感通道的病毒AAVMTF及用途

摘要

本发明公开了一种表达铁纳米颗粒和温度敏感通道的病毒AAVMTF及用途，该病毒包括AAVMTF1和AAVMTF2两种病毒，这两种病毒通过以下方法制备得到：首先进行目的片段构建设计，然后进行病毒AAVMTF的包装；AAVMTF1和AAVMTF2两种病毒分别具有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的基因序列。本发明的分别表达铁纳米颗粒以及温度敏感通道的病毒AAVMTF不需要植入电极或光纤，无动物组织损伤性；组织穿透性强，可进行全脑范围内弥散性的刺激；时间、空间精确性高；能够在清醒自由运动中的动物中进行实时控制；细胞特异性高；因此在脑功能的研究和临床神经精神疾病的治疗中具有更高的应用价值。

主权项

一种表达铁纳米颗粒以及温度敏感通道的病毒AAVMTF，其特征在于，它包括表达温度敏感通道的病毒AAVMTF1和表达铁纳米颗粒的病毒AAVMTF2，其中，所述病毒AAVMTF1通过以下方法制备得到：首先进行目的片段构建设计：TRPV1构建在CMV启动子下游，mCherry报告基因克隆于TRPV1通道下游，在mCherry和TRPV1之间有一个2A自身裂解片段，从而实现TRPV1和mCherry的非融合共表达；然后进行病毒AAVMTF1的包装：腺相关病毒经过表达、包装和包埋带有目的片段的质粒后，转染到HEK293T细胞系中，使其充分表达并形成病毒颗粒；48小时后将培养基收集，用多步离心法进行病毒颗粒的纯化和浓缩，最后将病毒溶解在灭菌的PBS中，分装并储存于‑80℃备用，从而得到病毒AAVMTF1，该病毒AAVMTF1具有SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述病毒AAVMTF2通过以下方法制备得到：首先进行目的片段构建设计：小鼠铁蛋白重链与小鼠铁蛋白轻链之间用一个可变链接区进行克隆，形成铁蛋白轻链‑连接体‑重链融合蛋白，在铁融合蛋白上游有段信号肽，在其下游是血小板源生长因子受体跨膜段PDGFR‑TM，在信号肽的作用下PDGFR‑TM可将铁融合蛋白锚定在膜上，EGFP报告基因克隆于PDGFR‑TM下游，在PDFGR‑TM和EGFP之间有一个2A自身裂解片段，从而实现锚定在膜上的铁融合蛋白和EGFP的非融合共表达，然后进行病毒AAVMTF2的包装：腺相关病毒经过表达、包装和包埋带有目的片段的质粒后，转染到HEK293T细胞系中，使其充分表达并形成病毒颗粒；48小时后将培养基收集，用多步离心法进行病毒颗粒的纯化和浓缩，最后将病毒溶解在灭菌的PBS中，分装并储存于‑80℃备用，从而得到病毒AAVMTF2，该病毒AAVMTF2具有SEQ ID NO.2所示的基因序列。