[发明专利]一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法

摘要

本发明涉及一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，所述方法依次包括：菌种的筛选与鉴定、菌种的诱导变异、龙脑的制备。本发明在成功分离了作用蒎烯的微生物-植生克雷伯氏菌，通过等离子和化学诱导；固态培养得到5×108cfu/g的曲料，使之耐受底物及耐候和立体选择性提高，达到耐受底物浓度为10%，生成的乙酸龙脑酯，其中正龙脑酯含量为66%~75%。本发明所述的方法在国内首次利用蒎烯微生物法生成乙酸龙脑酯，然后水汽蒸馏去除未作用的蒎烯，皂化水解制龙脑的新工艺。该方法生产的龙脑接近天然龙脑，其正龙脑含量为66%-75%，高于现有化学法工艺产品品质，其综合成本优于现行工艺。

主权项

1.一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述方法依次包括以下步骤：步骤一：菌种的筛选与鉴定原始菌株筛选：从自然界中取富含松节油的土壤和松树皮、叶样品，将分离得到的各纯菌株分别接种到经灭菌处理，盛有100份查氏培养基液的容器中，于30℃，150r/min条件下摇瓶培养48h，然后各加入2%蒎烯，在相同条件下发酵培养30h后，用气相色谱仪分析发酵产物情况，以乙酸龙脑酯为目标物对比选出最为理想的菌株作为试验菌株；富集培养结束后，取培养液1mL用无菌水依次稀释至10倍、5倍、10倍、6倍后涂布平板，待菌落生长后，挑取不同的菌落进行平板划线分离纯化，并保藏纯化的单菌落菌株；②菌株鉴定：根据菌株形态观察及生理生化试验结果以及16S rDNA序列同源性分析，结合《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，确定菌株为革兰氏阴性菌，且与植生克雷伯氏菌最相似，结合分子生物学结果，确认菌株为植生克雷伯氏菌；步骤二：菌种的诱导变异步骤一所得的菌种依次采用下列等离子诱导和化学亚硝基胍诱变：等离子诱导：取10mL菌液8000rpm/min离心10min，弃去上清液，用10mL生理盐水悬浮得菌悬液；取2ml菌悬液均匀涂布于等离子体装置的下电极介质上，电压24kV，电流1.7mA、间隙3mm的操作条件下照射0，10，15，20，30，50和70s，将处理过的菌液梯度稀释后，取1ml涂布于固体培养基平板上，37℃下蔽光培养2天，用平板菌落计数法进行活菌计数，绘制致死曲线，选取致死率70%~80%对应的时间为等离子体处理时间，进行一次冷等离子诱变，照射后立即稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，进行后续化学诱变；②化学亚硝基胍诱变：作用剂量为300~500ppm，诱变在pH5.0，0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中静息培养3h，然后稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，从挑选的30个单菌落中，选择3株产率最高的菌株，进行蒎烯发酵试验，进而再从其中选择1株产率最高的菌株；固态托盘培养制成原曲；步骤三：龙脑的制备原曲用0.02mo1/L的Na₂HP0₄-KH₂P0₄缓冲液洗涤2次，再用同一缓冲液制成浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液，5%定量接种于含有3%蒎烯的无机盐培养基中，在150r/min，30℃进行转化；底物采用多次加入的方式，反应在一个相对密闭的摇床中进行，在反应刚开始时，于培养液中加入3%的底物，转化24h后再加入2%底物和5%浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液，再连续加入两次，最后一次加入1%底物和5%浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液后继续反应需多于2d，生物转化反应共进行6d，发酵完成后，加入洗涤分离釜，上层蒸轻油，皂化蒸片，粗片重结晶即得龙脑。