[发明专利]一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法

摘要

本发明涉及一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，利用机械法分离人皮肤干细胞，体外培养人皮肤干细胞，利用人皮肤干细胞体外形成拟胚体的方法进行分化，分化后用骨形态发生蛋白-4、干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子体外诱导14天，可获得一些能够表达早期生殖细胞基因的原始生殖细胞样细胞；之后采用猪的卵泡液进行诱导。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达原始生殖细胞样细胞，细胞荧光分析体外诱导得到的原始生殖细胞样细胞表达Stra8和Dazl，能够达到早期减数分裂。

主权项

一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，其特征在于：按照如下步骤操作：第一步，人皮肤的分离：将人的皮肤取下，转移至磷酸盐缓冲液+10%胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3次，去掉与皮肤连接在一起的血凝块和脂肪；在新鲜DMEM/F12中将分离干净的皮肤洗3次；第二步，皮肤干细胞的体外培养：皮肤经DMEM/F12洗完后，用剪刀剪碎，再经DMEM/F12洗3遍；然后置于0.25%Trypsin‑0.04%EDTA，37℃消化，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，DMEM/F12中洗3遍，最后用移液枪吹打，直至组织能够自由进入枪头，将吹打好的组织过筛到皮肤干细胞培养液培养；所述皮肤干细胞培养液包含：DMEM/F12、2%B‑27、20ng/ml表皮生长因子、40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1%青链霉素，以培养当天为零代，每4天传代一次；第三步，皮肤干细胞体外形成拟胚体：当皮肤干细胞培养到第二代3‑4天时，离心收集细胞，弃上清，加入0.25%Trypsin室温消化，然后轻轻吹打至单细胞，终止消化，Medium199洗两遍后转入SARSTEDT悬浮培养24孔板，置于拟胚体培养基中培养，拟胚体培养液包括：pH7.0的Medium199、3mg/ml牛血清蛋白、1mg/ml胎球蛋白、5ul/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠、0.23mM丙酮酸钠、1ng/ml表皮生长因子、20ng/ml激活素A和30ng/ml的骨形态发生蛋白‑4；第四步，拟胚体培养3‑4天后开始向原始生殖细胞分化：用0.25%Trypsin消化拟胚体，室温消化过程中用移液枪吹打至单细胞，用血清终止消化，收集细胞，离心；弃上清，加入培养液悬浮细胞；之后接种到24孔板中，每个孔接种细胞密度为5×104；将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2中培养14天，培养液包括：DMEM高糖、10%胎牛血清、0.23mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、2mM L‑谷氨酰胺、0.1mMβ‑巯基乙醇、20ng/ml表皮生长因子、40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、40ng/ml干细胞生长因子、1uM视磺酸和30ng/ml骨形态发生蛋白‑4；第五步，猪卵泡液继续培养：将24孔板的细胞消化下来，接种到用多聚赖氨酸处理过的培养皿里，每个培养皿的接种密度为1×104，换成猪卵泡培养液进行培养；猪卵泡培养液包括：DMEM高糖、5%猪卵泡液、5%胎牛血清、0.23mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、2mM L‑谷氨酰胺和0.1mMβ‑巯基乙醇。