[发明专利]一种用于筛选转基因动物生物标志物的血清代谢组学方法

摘要

一种用于筛选转基因动物生物标志物的血清代谢组学方法，采用超高效液相色谱-质谱技术对正常动物与转基因动物血清进行分析获得代谢指纹图谱，并通过多变量统计分析方法分析比较正常动物与转基因动物代谢指纹图谱差异，筛选出转基因动物潜在生物标志物。本发明可更全面、综合地体现转基因动物代谢产物的变异状况，适用于转基因动物生物标志物的筛选。

主权项

一种用于筛选转基因动物生物标志物的血清代谢组学方法，其特征在于：采用超高效液相色谱‑质谱技术对正常动物与转基因动物血清进行分析获得代谢指纹图谱，并通过多变量统计分析方法分析比较正常动物与转基因动物代谢指纹图谱差异，筛选出转基因动物潜在生物标志物；所述获得代谢指纹图谱的具体实现步骤如下：（1）血清样品采集：收集n只正常动物与m只转基因动物的血液，血液分别置于不含肝素的负压管中，负压管在冰上凝集15‑20min，在温度为4‑8℃、离心力为1600‑1800g条件下离心时间15‑20min后取上清液，即为所需的n+m个血清样品；其中n为大于5的正整数，m为大于5的正整数；（2）血清样品预处理：于血清样品中分别加入其2‑4倍体积的乙腈沉淀蛋白，在温度为2‑4℃、离心力为12000‑15000g条件下离心时间10‑15min，后取上清液，即得到n+m个血清样本；（3）样品质谱分析：对n+m个血清样本依次进行超高效液相色谱质谱联用分析，液相色谱条件：采用Waters公司ACQUITY UPLC液相色谱系统，该系统含二元溶剂管理器、样品管理器和HT柱温箱；色谱柱为Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18柱，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温：45℃；进样量：1‑5μL；流动相：A为5mM甲酸氨+0.1%甲酸水溶液，B为5mM甲酸氨+0.1%甲酸溶液；梯度洗脱条件：0～1min为99%A相，1‑23min线性变化至100%B相并保持3min，再切换99%A相并保持2min；流速为0.45ml/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；质谱条件：应用Waters Xevo G2QTof串联四级杆飞行时间质谱系统进行检测，其条件为电喷雾ESI离子源，扫描方式：正、负离子扫描模式，毛细管电压：2.5KV，锥孔电压：30V，离子源温度：120℃，脱液剂气温度：450℃，锥孔气流量：20L/h，脱液剂气流量：800L/h，碰撞能量:10～40V，离子能量：1V，每0.2s采集1次图谱，质量扫描范围：20～1200m/z，依次获得被分析血清样品的总离子流图；最终得到n+m个样本的总离子流图，其即为血清代谢指纹图谱。