[发明专利]一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及应用；具体涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗的应用。本发明所述制备方法简单、快捷，适于产业化生产；此外，本发明的药效学研究，结果表明，所述酪氨酰tRNA合成酶突变体可用于治疗肿瘤放、化疗诱导的血小板减少症。

主权项

一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）工程菌高密度发酵工程菌复苏及摇瓶接种：取出原始祖种子菌，100 级洁净度条件下，在 LBK 平板上接种，37℃ 培养 2‑3 天；从平板上挑取单菌落，100 级洁净度条件下接种于 20ml 含 50 μg/ml kanamycin LB培养液中，30℃ 振摇培养 8 小时，至 OD600 为 2，制得一级种子液；将上述一级种子液加入 300 ml LBK 培液中，30℃ 振摇培养 6 小时，至 OD600 为 2，制得二级种子液；（2）发酵罐及 Sl 培养基高压灭菌清洗发酵罐，安装好各个管道，按校正程序进行 pH 校正，加入 3.2 L S1 培养基，121℃ 1.5kg/cm2 高压灭菌 20 min，冷却至室温；溶氧DO 电极校正和设定各种参数，发酵罐温度设定为 30℃；无菌条件下，向发酵罐中加入 S2、S3、S4 和 S5培养基；通入纯氧，搅拌速度设定为 500 rpm，待 DO 稳定后，按 DO 校正程序将此时 DO 值设定为 100%；（3）二级种子液接种培养及 IPTG 诱导酪氨酰 tRNA 合成酶突变体表达在无菌条件下，将所述二级种子液接种入发酵罐内，通入空气，进行扩增培养；每隔 1 h 取样 5ml，测定 OD600;控制 DO 50%±10%，观察 pH、温度、搅拌转速；pH 以氨水调节，随时流加适量消泡剂；至 OD600 30，加入 IPTG 诱导 6 小时，停止发酵，4000 rpm × 20 min 离心，收集菌体；工程菌在发酵罐内生长至 OD600 30，加入 IPTG ，终浓度为 0.5 Mol/L，诱导目的蛋白表达，诱导 6 小时后，表达量占全菌总蛋白的 50%，每升培液收获湿菌 100g；（4）纯化酪氨酰 tRNA 合成酶突变体①高压破菌菌体用醋酸缓冲液以 1:10 w/v 重悬，将混悬液倒入均质机，300 bar 压力下，完成均质，1000 bar 压力下，完成破菌；10,000 rpm × 30 min 离心，分离上清；②阳离子交换层析，洁净度 10000 级，4℃层析柱规格为 12.5 cm × 40 cm，填料为 SP‑Sepharose Fast Flow，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用NaAc‑HAc平衡，将上述分离得到的上清上样，流速 15ml/min；用 NaAc‑HAc 冲洗至 OD280 达到基线，流速 15ml/min，用 NaAc‑HAc‑NaCl线性梯度洗脱，流速 15ml/min，监测 OD280，收集活性组份；③凝胶过滤层析，洁净度 10000 级，4℃层析柱规格为 12.5 cm × 100 cm，填料为 SephadexG‑50，纯化使用 AKTA Explore 系统完成，用 0.02Mol/L PB 平衡，将经过阳离子交换层析收集的样品自动进样，用 0.02 Mol/L PB 洗脱，流速 10ml/min，监测 OD280，收集活性组份；④阴离子交换层析，洁净度 10000 级，4℃层析柱规格为2.6 cm × 10 cm，填料为 Q‑sepharose Fast Flow，纯化使用AKTA Explore 系统完成，用 0.02 Mol/L PB 平衡，经凝胶过滤层析收集的组份上样，流速 15 ml/min，收集上样峰组分；一次发酵，纯化工艺如下表所示：1 次 5L 规模的发酵，收集菌体 100g，经 3 步纯化，获得纯度 ＞ 95% 的 酪氨酰 tRNA 合成酶突变体 蛋白 350 mg；  体积 (L)蛋白浓度(mg/ml)蛋白总量 (mg)回收率 (%)发酵收集菌体100 g (重悬1 L)1.0 mg/ml1000 mg0阳离子交换层析0.2 L2.0 mg/ml400 mg40%凝胶过滤层析0.3 L1.33 mg/ml400 mg40%阴离子交换层析0.15 L2.33 mg/ml350 mg35%。