[发明专利]一种基于液相芯片检测痰液microRNAs用于早期肺癌诊断的方法

摘要

本发明公开了一种基于液相芯片系统定量检测痰液miRNAs，用于早期肺癌筛查的方法及试剂盒。本发明的方法具体如下：合成针对这些miRNAs的寡核苷酸探针，偶联好寡核苷酸探针的荧光编码微球混合后得到液相芯片，并根据其探针的序列和目的miRNAs的序列设计嵌合探针，与液相芯片进行杂交，再用藻红蛋白进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪检测结果。通过对临床确诊肺癌患者、非肺癌患者检出值，经统计学处理确定肺癌早期筛查最佳痰液miRNAs检测组合(关键性指标4个miRNAs，辅助性指标4个miRNAs)，制备一种用于早期肺癌筛查的痰液miRNAs液相芯片定量检测试剂盒。

主权项

一种基于液相芯片系统进行早期诊断肺癌的方法，其特征在于包括以下步骤： ①选取肺癌特异性miRNAs和内参基因，设计嵌合探针序列，探针5’末端进行生物素修饰，探针序列如下： miR‑21： 5’‑UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUACTTTAATCTCAATCAATACAAATC‑3’ miR‑155： 5’‑ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAATACACTTTATCAAATCTTACAATC‑3’ miR‑205： 5’‑CAGACUCCGGUGGAAUGAAGGAATACTTCATTCATTCATCAATTCA‑3’ miR‑125b： 5’‑UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGACAATTCATTTACCAATTTACCAAT‑3’ miR‑708： 5’‑CCCAGCUAGAUUGUAAGCUCCUUCTACTATACATCTTACTATACTTT‑3’ miR‑210： 5’‑UCAGCCGCUGUCACACGCACAGTCAATCAATTACTTACTCAAATAC‑3’ miR‑200b： 5’‑UCAUCAUUACCAGGCAGUAUUAATTATTCACTTCAAACTAATCTAC‑3’ miR‑106a： 5’‑CUACCUGCACUGUAAGCACUUUUCTTCTCATTAACTTACTTCATAAT‑3’ miR‑126： 5’‑CGCAUUAUUACUCACGGUACGACTATCTTCATATTTCACTATAAAC‑3’ miR‑486‑5p： 5’‑CUCGGGGCAGCUCAGUACAGGATCATTTCACAATTCAATTACTCAA‑3’ miR‑191： 5’‑CAGCUGCUUUUGGGAUUCCGUUGTCATCAATCTTTCAATTTACTTAC‑3’ miR‑103： 5’‑UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCUCAATATACCAATATCATCATTTAC‑3 ②液相芯片的制备：根据检测目的将偶联好探针的不同荧光编码微球混合，得到液相芯片。 ③标本检测：从标本中提取总RNA，根据检测目的选择步骤①中所述的嵌合探针与目的miRNAs进行杂交；接着将杂交后产物与步骤②得到的液相芯片再进行杂交；再用藻红蛋白对杂交产物进行标记，通过液相芯片检测仪读出检测结果。 ④确定待检人群是否为患有肺癌的高危人群，其痰液中的miRNAs表达谱必须含有一个已经确定的miRNAs异常表达谱以及至少两种以上其他的肿瘤特异性miRNAs呈阳性。