[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法

摘要

本发明公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。

主权项

1.谷氨酸棒杆菌基因及其突变基因的原核表达方法，其特征在于：所述方法所使用的材料为菌株大肠杆菌BL21及pET-28a(+)原核表达载体，由以下步骤实现：1)、DAHP合成酶基因及突变基因的原核表达载体构建；2)、目的基因与表达载体pET-28a(+)的酶切，限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切重组质粒pMD18T-simple-Aro I和pMD18T-simple-Aro I*，回收目的基因片段，分别按照下表中体系进行加样，对目的基因和pET-28a(+)载体于37℃恒温4h进行双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；3)、回收片段的连接，将回收的带有粘性末端的AroI和AroI*基因的ORF片段及载体片段用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃；4)、重组载体转化、鉴定，将重组载体转化，然后进行酶切与PCR鉴定，正确的重组质粒进行序列测定，测序验证正确的载体分别命名为pET-28a(+)-AroI和pET-28a(+)-Aro I*，其中阳性克隆的筛选标记抗生素为卡那霉素；5)、Aro I和Aro I*基因在大肠杆菌中的诱导表达，分别将过夜培养的含有表达载体pET-28a(+)-Aro I和pET-28a(+)-Aro I*的大肠杆菌1.2ml加入到装有100ml含Kan(60mg/L)的LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃，200g，振荡培养至OD600约等于0.6时，加入终浓度分别为1.0mM的IPTG；30℃，200g振荡培养，诱导表达5h后，8000g离心5min收集菌体，菌体以50ml的含0.2mg/ml溶菌酶和10mM DTT的磷酸钠缓冲液(20mM，pH7.2)悬浮，反复冻融4次，再以超声波破碎(工作10s，间隙10s，30个循环，功率600W)；破碎后的样品于13000g，4℃离心10min，上清液即为粗酶液；6)、SDS-PAGE电泳，对上述步骤5)粗酶液分别进行SDS-PAGE以检测表达情况，同时以没进行诱导的菌液作为阴性对照，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的浓缩胶浓度用4％，分离胶浓度取12.5％，蛋白样品上样前先加入等体积的2×SDS-PAGE样品处理液(6％β-巯基乙醇；6％SDS；0.6％溴酚蓝；20％甘油)，在沸水浴中煮5min，10000g离心3min后取上清液上样，采用恒压200V，电泳45分钟左右结束，用考马斯亮蓝R-250染色；7)、DAHP合成酶Western blotting分析，阳性菌株表达产物分别经SDS-PAGE电泳后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，用封闭液室温封闭2h，PBS洗膜3次，每次10min，在加入以1∶1000稀释的鼠抗6×His单克隆抗体室温反应过夜，同上洗膜，再以相应的1∶500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，再次洗膜，最后经DAB底物显色液显色分析；8)、表达产物生物学活性的测定和比较，将1ml10mM磷酸缓冲液(pH6.8)100μl5mM赤藓糖-4-磷酸和50μl10mM的磷酸烯醇式丙酮酸混匀后，37℃水浴保温10min；然后加入1μl0.1M CoCI2和200μl酶液，37℃水浴反应30min；加入0.4ml100g/L三氯乙酸终止反应，随后10000rpm离心5min，取0.25ml上清和等体积的0.025M的高碘酸溶液充分混匀，25℃反应45min，再加入0.5ml20g/L的亚砷酸钠溶液，25℃反应2min，然后加入2ml3g/L的硫巴比妥溶液，混匀后沸水浴加热反应5min，离心去除溶液中不溶物质，测定OD549。