[发明专利]一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法

摘要

本发明提出了一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法，它是通过生殖工程性品种改良技术，对远缘杂种进行胚胎工程、组织培养技术，建立了诱导杂交果愈伤组织加倍形成远缘杂交多倍体杂种系，步骤为：a.远缘杂种果实的获得；b.杂交果的愈伤组织诱导；c.杂交果愈伤组织的秋水仙素处理；d.处理后愈伤组织的恢复培养；e.愈伤组织分化出芽苗；f.芽苗分化出根；g.组培植株的移植；h.成活植株的比较观察与选择；i.选株的无性扩繁成稳定品种（系）。本发明解决了现有桑树生长缓慢，适应性不强和构树主干不明，材质较差的问题，而培育出主干明显、适应性强、材质较好的多倍体构树桑树新杂种。

主权项

一种远缘杂交和多倍体化选育构树桑树新杂种的方法，其特征在于选育过程为：a.远缘杂种果实的获得远缘杂种是以生长旺盛，无病虫害的优良桑树品种和野生构树为亲本，利用构树桑树雌雄异株的特性，选用雌构树为母本进行套袋，父本桑树的花粉采集于初花期，取出花药于干燥处晾干，待花药开裂、花粉散出后将花药用纸包好，放在底层有干燥剂的干燥器中储存；在构树品种始花至终花、柱头上出现粘液时，分2次～3 次授粉，授粉后每隔一天对杂交果喷施50mg/L‑100mg/LGA3 + 20mg/L‑30mg/L NAA的激素，2周后,获得杂交果；b.杂交果的愈伤组织诱导取回杂交果经流水冲净后，先在 0.1%新洁尔灭（5%）溶液中浸泡 30 min，然后用0.1%升汞消毒8～10min ，再用无菌水洗 3次～4 次，将消毒后的杂交果，放在超净工作台上除去果实外绒毛，切成1/2‑1/4大小并保留0.5cm‑0.8cm叶柄，再将切好的果子切割面朝下水平放入到杂交果愈伤组织诱导培养基中，置于20001X光照10hr/d，25℃条件下培养，20天‑25天果实发生膨大并在果实中心处或切面出现紧密的乳白色团状愈伤组织；所述杂交果的愈伤组织诱导培养基配方为：MS +1.0mg/L‑ 2.5mg/L 6‑BA + 0.1mg/L‑0.5mg/L NAA + 4%蔗糖 + 0.75% 琼脂 ，pH5.8；c．杂交果愈伤组织的秋水仙素处理当杂交果愈伤组织生长到40天‑45天时，将愈伤组织置于添加500mg/L～750mg/L秋水仙素，不加琼脂的杂交果愈伤组织加倍培养液中，放在温室（26℃）摇床上，在100转～120转/分钟的速度下旋转培养处理48hr～60hr；所述加倍培养基配方为：MS +1.0mg/L‑ 2.5mg/L 6‑BA + 0.1mg/L‑0.5mg/L NAA + 500mg/L～750mg/L秋水仙素 + 4% 蔗糖 ，pH5.8；d．处理后愈伤组织的恢复培养杂交果愈伤组织加倍处理完毕，取出愈伤组织经无菌水冲洗和吸干表面水分后，接种到杂交果愈伤组织诱导培养基上，恢复培养7天；e．愈伤组织分化出芽苗经恢复培养的愈伤组织接种到分化培养基中分化培养，15天‑20天后愈伤组织出现绿芽，25天‑35天后陆续分化出芽苗，并可见丛苗出现；所述分化培养基配方为：MS + 2.0mg/L～3.5mg/L 6‑BA + 0.1mg/L‑0.3mg/L NAA + 3%蔗糖 + 0.75% 琼脂,pH5.8；f．芽苗分化出根当芽苗分化生长到2.0cm‑5.0cm高时，将芽苗靠近愈伤组织处剪断移植于生根培养基中，25天‑30天后芽苗基部分化出根而形成完整的组织培养植株；所述生根培养基配方为:1/2 MS +0.1mg/L‑ 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L‑2.0mg/L IBA + 2% 蔗糖 + 0.75% 琼脂，pH5.8；g．组培植株的移植当组培植株生长到8.0cm‑12.0cm高、具有1条～3条根的时候，将进行组培植株的移植，首先将要移植植株的培养瓶盖打开，每瓶添加10ml～15ml无菌水，放到常温的实验室内缓苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培养基，将植株移栽到灭菌的70%蛭石+15%细砂+15%园土的基质中，浇上1/10MS大量元素溶液，盖上薄膜和黑网（50%遮光率）；然后每2天喷洒1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭开黑网和薄膜，使组培苗健壮生长；h．成活植株的比较观察与选择根据杂种植株和亲本植株外部形态的差异，选取叶片上面光滑无毛，下面沿叶脉疏生毛形似桑树的植株为初选杂合体株，再将杂合体叶片和亲本叶片的DNA提取出来,采用SSR分子标记对其进行序列比对，即使用同一SSR引物对杂种和亲本基因组体外扩增，将扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，比较杂种和亲本基因组标记序列相似度，结果被测植株显示两个亲本植物的标记而确定为杂合体，经根尖染色体检查区分二倍体杂种和多倍体杂种；i.选株经无性扩繁成稳定品种将已确定为构树桑树杂合体的单株生长到80cm‑100cm时截取枝条，按每茎段含3个芽作为繁殖茎段，于立春后的3天‑15天内插植于苗床上进行无性扩繁，而成为稳定的杂合体构树桑树品种。