[发明专利]山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法

摘要

本发明公开了山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，包括以下步骤：（1）卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养挑取的卵丘卵母细胞复合物经操作液清洗后，置于成熟液中，培养时，将维甲酸添加到成熟液中，50～80个卵丘卵母细胞复合物/孔，覆盖矿物油，于饱和湿度下，38.5°C培养；所述操作液组分为TCM199+5%FBS+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素；所述成熟液组分为TCM199+10%FBS+10IU/mlPMSG+5IU/mlhCG +0.1mg/mlL-半胱氨酸+10ng/mlEGF；（2）卵丘细胞凋亡相关基因表达检测（3）卵丘细胞凋亡末端标记检测。本发明在山羊卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养过程中，添加维甲酸（RA）能够有效地抑制卵母细胞外周卵丘细胞的凋亡，进而促进山羊卵母细胞细胞核与细胞质的成熟。

主权项

山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，包括以下步骤：（1）卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养卵巢采集于屠宰场宰杀后的山羊，分离出2～8mm卵泡中的卵丘卵母细胞复合物；挑取有3～5层致密卵丘包裹的卵母细胞用于成熟培养；挑取的卵丘卵母细胞复合物经操作液清洗后，置于成熟液中，培养时，将维甲酸添加到成熟液中，50～80个卵丘卵母细胞复合物/孔，覆盖矿物油，于饱和湿度下，38.5°C培养；所述操作液组分为TCM199 + 5% FBS + 100 IU/ml 青霉素 + 0.1 mg/ml 链霉素；所述成熟液组分为TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG  + 0.1 mg/ml L‑半胱氨酸 + 10ng/ml EGF；（2）卵丘细胞凋亡相关基因表达检测成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶液滴中脱去卵丘细胞； 收集卵丘细胞置于1.5ml 离心管中，离心去上清后，提取卵丘细胞总RNA；将总RNA反转录至cDNA；经荧光定量PCR分析凋亡相关基因表达水平；（3）卵丘细胞凋亡末端标记检测成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X‑100通透； 经原位末端转移酶标记技术进行标记， Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测；对于单个卵丘细胞凋亡的检测，成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶消化后，收集卵丘细胞；卵丘细胞离心洗涤后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X‑100通透； 经原位末端转移酶标记技术进行标记， Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测。