[发明专利]双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立

摘要

一种双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立，该建立方法包括构建serpin基因自杀型打靶载体UPD；以pDG7为骨架，装载上双歧杆菌的启动子，构建双歧杆菌-大肠杆菌的穿梭表达载体pDG-Hup；在pDG-Hup基础上构建Cre酶基因的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pDG-hup-cre；将打靶载体转化入双歧杆菌，通过同源重组得到双歧杆菌serpin基因缺失株；利用位点特异性重组酶体系Cre-loxp系统，将双歧杆菌基因组中引入的壮观霉素spc基因移除，实现了双歧杆菌抗性基因的无痕敲除。本发明利用同源重组的原理获得双歧杆菌功能基因的缺失株，可应用于双歧杆菌功能基因的敲除，改良菌种。

主权项

一种双歧杆菌功能基因无痕缺失株的建立方法，其特征是，包括以下步骤：(1)   将SEQ ID.NO.1通过EcoR V位点和Pst I酶切连接到pUC57载体上，得到pUC57‑LoxP载体；(2)   以pER8质粒为模板，通过引物SEQ. ID.NO.2和SEQ. ID.NO.3扩增壮观霉素抗性基因spc，将扩增产物经过Xho I和Apa I双切后与pUC57‑LoxP载体连接，构建得到载体pUC‑Spc；(3)   以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ. ID.NO.4和SEQ. ID.NO.5扩增，将扩增产物经过EcoR I和 Spe I双切后与pUC‑Spc载体连接，构建得到载体pUC‑spc‑serpinup800；(4)   以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ. ID.NO.6和SEQ. ID.NO.7扩增，将扩增产物经过Bgl II和Hind Ⅲ双切后与pUC‑spc‑serpinup800载体连接，构建得到打靶载体质粒pUC‑spc‑serpinup+down，即UPD；(5)   SEQ. ID.NO.8 序列经EcoR I和Sal I双酶切连接至pDG7，构建穿梭表达载体pDG‑Hup；(6)   以含有Cre酶基因的pCrepA质粒为模板，通过引物SEQ. ID.NO.9和SEQ. ID.NO.10扩增Cre酶基因；扩增产物经过Xho I和Sal I双切后，与pDG‑Hup连接，构建得到pDG‑Hup‑Cre；(7)   打靶载体的转化： 将打靶载体质粒pUC‑spc‑serpinup+down加入到双歧杆菌原生质体中，融合转化；洗涤、复苏，复苏之后将菌液涂布在具有壮观霉素的再生培养基上培养2‑3 d，得到⊿serpin株；(8)   将⊿serpin株制成原生质体感受态细胞，将穿梭表达载体pDG‑Hup‑Cre导入⊿serpin株，融合转化，将转化后菌落涂布在氨苄青霉素抗性的再生培养基上，筛选到不再携带壮观霉素抗性基因的双歧杆菌serpin基因无痕缺失株⊿serpin⊿spc株。