[发明专利]一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法

摘要

本发明涉及一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，按照如下步骤操作：第一步，利用机械法分离出生后7天小鼠触须部毛囊；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养；第三步，将传代两次的毛囊干细胞体外培养形成拟胚体EB；第四步，制作小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞分化。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的原始生殖细胞。

主权项

一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，分离小鼠触须部毛囊：用手术镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下，转移至磷酸盐缓冲液pH7.0+10%胎牛血清的操作液中清洗，并去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪，在新鲜细胞培养液DMEM/F‑12中将毛囊清洗；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F‑12洗完后，置于0.25% Trypsin‑0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，以培养当天为零代，每4天传代一次；第三步，毛囊干细胞体外形成拟胚体EB：当毛囊干细胞培养到第二代又3‑4天时，离心收集细胞，弃上清，加入0.25% Trypsin室温消化5分钟，然后轻轻吹打至单细胞，终止消化，Medium 199洗两遍后转入24孔板悬浮培养，置于EB培养基中培养；第四步，小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞的制作：将怀孕13.5天的母鼠杀死取出胎鼠，取出头、四肢、内脏、尾将躯干转移至磷酸盐缓冲液清洗，置于0.25% Trypsin‑0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后，加入10%胎牛血清终止，转入成纤维细胞培养基中培养，以培养当天为零代，细胞达90%汇合度时传代；取1‑3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入含有10μg丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，置于培养箱中1.5‑2小时，取出用磷酸盐缓冲液清洗，用0.25%Trypsin将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止后DMEM高糖清洗，转入24孔板贴壁培养；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞PGC分化：用0.25% Trypsin消化EB,室温消化过程中用枪吹打至单细胞，用血清终止消化，收集细胞，离心；弃上清，加入PGC培养液悬浮细胞，将细胞稀释到细胞浓度为5×104个/ml PGCs培养液里；向铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的24孔中加入0.5ml重悬的细胞，将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2中培养；培养液包括：DMEM高糖,10%胎牛血清，0.23mM丙酮酸钠，0.1mM Non‑Essential Amino Acids，2mM L‑谷氨酰胺，0.1mM β‑巯基乙醇,20ng/ml表皮生长因子,40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,40ng/ml干细胞生长因子。