[发明专利]一种在白术生长期检测抗性标志物的方法

摘要

本发明公开了一种在白术生长期检测其抗性标志物的方法。该方法是在白术土传病高发期，采集自然状态下感病植株与抗病植株；同时，采用伤根法接种白绢菌菌丝，待感染发病后分别采健康和发病植株，采用HPLC法测定样品植株中主要代谢物白术内酯类水平，进行组间差异比较，确定显著性差异组分，筛选与白术抗性有关的标志性代谢物，并以罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)为受试菌，进行该组分的毒力测试，证明白术内酯II的抑菌功效，以此获得抗性标志物，用于白术抗性评价、抗性品种选育等方面。

主权项

一种在白术生长期检测抗性标志物的方法，其特征在于：A种植白术，按常规进行田间管理，于5‑7月白术土传病害高峰期采集自然状态下抗病植株A1与感病植株A2各30株以上，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用；B采用伤根法接种罗氏白绢小菌核菌，1‑3周后分别采健康B1和发病植株B2各30株以上，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用；C采用HPLC法测定A步骤和B步骤的样品中白术内酯类的含量值，并采用单因素T检验分析A1与A2、B1与B2组间水平的差异，确定在白术抗病植株与健康植株中明显高表达的代谢物为白术内酯II，并进一步采用对照品追加法鉴定此代谢物为白术内酯II；HPLC法测定的条件为：色谱条件色谱柱：Sun Fire C18，250mm×4.6mm，5μm，流动相甲醇A‑水B，梯度洗脱程序为0～16min，60％～76％A；16～18min，76％～100％A；18～30min，100％A；体积流量1mL/min，柱温25℃，白术内酯I、III检测波长为220nm、白术内酯II检测波长为276nm，进样量20μL；对照品溶液的制备：精密称取白术内酯I、II、III对照品适量，用甲醇配制成含有白术内酯I、II、III分别为0.266、0.100、0.341mg/mL的混合对照品溶液；供试品溶液的制备：精密称取白术样品粉末0.5g，加入8mL甲醇，超声30min，静置后用甲醇定容至10mL，摇匀，得50mg/mL的供试品溶液；D采用体外抑菌实验验证候选标志物对白术致病菌的抑制活性，以罗氏白绢小菌核菌为受试菌种，分别测试对该致病菌的毒力，与白术内酯I、白术内酯III比较，明确白术内酯II有明显的抑制作用，实验证实代谢物白术内酯II为与白术抗病性有关的标志物；其中体外抑菌验证方法步骤如下：分别取0.01ml不同浓度甲醇母液内酯I，II，III于10ml培养基中，使成200、100、50、25、12.5μg/ml的培养基；采用生长速率法进行毒力测定；以罗氏白绢小菌核菌为供试菌种；无菌条件下在各个病原菌菌落边缘用打孔器打取菌饼直径分别接种于各处理培养基平板中央每皿接1个菌饼，每处理3次重复，25℃培养72小时，采用十字交叉法测量菌落直径，应用DPS软件进行统计分析，计算毒力回归方程、有效中浓度及相关系数。