[发明专利]一种模拟体内微环境的干细胞培养体系及用途

摘要

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种模拟体内微环境的干细胞培养体系及用途；本发明利用琼脂糖构建三维支架材料，模拟体内微环境动态培养干细胞，使干细胞维持自我更新、增殖、归巢及向内皮细胞定向分化。本发明还比较二维培养及三维干细胞在正常及低氧环境下的生物学功能差异，利用EGFP基因示踪的方法和成像技术，体内移植修复Apo E基因敲除小鼠内皮损伤，从多能转录因子表达、生长因子分泌、细胞外基质成分、细胞膜内信号分子活化等多个方面，测定三维干细胞维持自我更新、增殖、归巢及向内皮细胞定向分化的遂平。本发明能用于血管损伤修复中，以及为干细胞疗法促进损伤血管的早期再内皮化的应用奠定理论基础及实验依据。

主权项

一种模拟体内微环境的干细胞培养体系，其特征在于，利用琼脂糖构建三维支架材料，并模拟体内微环境动态培养干细胞，使干细胞维持自我更新、增殖、归巢及向内皮细胞定向分化；其包括步骤：(1)构建干细胞培养的三维支架材料称取琼脂糖，高温溶解，低温冷却，制备三维胶原支架材料，检测其硬度及生物相容性；(2)建立干细胞三维培养体系建立模拟体内微环境的干细胞三维培养体系；通过流式分析、免疫荧光、RT‑PCR、Elisa方法鉴定并比较二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下的表型、生长特性及旁分泌因子或蛋白的差异；(3)检测三维培养干细胞自我更新调控能力利用基因芯片技术对二维及三维培养的干细胞进行比较，分析在不同培养条件下干细胞的基因表达差异，利用qRT‑PCR、：Western blot、Confocal共定位和RNA干扰技术检测Nanog、Sox2、Oct4多能转录因子的功能及调控能力；(4)检测三维培养脂肪干细胞向内皮细胞诱导分化将二维和三维培养的干细胞在不同培养条件下进行多向诱导内皮、骨、软骨、脂肪分化，测定其向内皮细胞诱导分化过程中的细胞表型、标志蛋白表达及再生内皮细胞功能等的差异；(5)检测三维培养干细胞向内皮定向分化的调控水平利用EGFP基因示踪二维及三维培养的干细胞体内移植修复Apo E基因缺陷小鼠内皮损伤模型，观察干细胞的存活、迁移、归巢及分化，从分子基因、蛋白、细胞与组织水平，确定三维培养脂肪干细胞自我更新及向内皮细胞定向分化的水平。