[发明专利]一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法

摘要

本发明公开了一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括鳃上皮组织的取样、制备培养液、组织块培养、鳃上皮细胞的纯化、鳃上皮细胞的传代培养的步骤。本发明对异育银鲫鳃上皮细胞的分离、培养和纯化等培养过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明异育银鲫鳃上皮细胞的原代培养方法，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h，大大缩短了培养时间，所建立的异育银鲫鳃上皮细胞模型可用于外源物质的细胞毒性、离子交换规律等相关研究，并为这些研究提供了便利。

主权项

一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，其特征是包括以下步骤：(1) 鳃上皮组织的取样：选取50‑100g的健康异育银鲫禁食24h后经麻醉，放入70％乙醇中消毒l min；在无菌室中取出鳃，用磷酸盐缓冲液冲洗数次，去除鳃黏液，将鳃剪碎得体积为0.9‑1.1 mm3的组织块，备用；(2) 制备培养液：在每毫升DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清；(3) 组织块培养：在步骤(1)得到的异育银鲫鳃组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入含5％胎牛血清的DMEM终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入步骤(2)的培养液制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，置25‑30℃，5％CO2培养箱培养；培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的鳃上皮细胞；(4) 鳃上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(3)得到的鳃上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104 /ml，种植在细胞培养瓶中，置25‑30℃，5％CO2培养箱培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1‑2次，得到预纯化鳃上皮细胞；去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸混合消化液，至倒置显微镜下观察80‑90%细胞回缩时终止，得到纯化后的鳃上皮细胞；(5)鳃上皮细胞的传代培养：将步骤(4)纯化后的鳃上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2‑3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×104 /ml的密度植入培养瓶中于25‑30℃，5％CO2培养箱培养，隔日更换培养液。