[发明专利]一种多基因载体组装方法与应用

摘要

本发明公开了一种多基因载体组装方法与应用，属于基因工程技术领域。该方法包括如下步骤（1）采用含有酶切位点的重叠引物对三个基因片段进行PCR扩增，通过1.33×连接buffer将三个片段连接成重组质粒；（2）重组质粒含有单一酶切位点，在每个插入基因对应的重叠引物内加上质粒单一酶切位点末端碱基，将重组质粒用相应的酶进行酶切，依次用1.33×连接buffer将重组质粒酶切片段和PCR扩增片段连接成新的重组质粒。（1）中引入的多个酶切位点，可以为后续的多基因酶切连接做基础；（2）不仅可以减少质粒单酶切后自连以及目的基因反向连接，而且只需要一个合适的酶切位点，就可以连接所有的目的基因片段。

主权项

一种多基因载体组装方法，其特征在于包括如下步骤：（1）配制1.33×连接buffer；（2）利用生物软件分析预重组的各基因片段，分别命名为A、B、C、D、E、F等基因，筛选出这些基因片段都不含有的酶切位点，分别命名为a、b、c、d、e、f等酶切位点；（3）从预重组的各基因片段中随机筛选出A、B、C三个基因片段，针对该三个基因片段设计出含有a、b、c、d、e、f等酶切位点的重叠引物；（4）用步骤（3）设计的重叠引物对A、B、C三个基因片段进行PCR扩增回收；（5）在冰上取15μL步骤（1）的1.33×连接buffer和步骤（4）中等摩尔数的A、B、C三个基因片段共5μL混合均匀，在30～60℃下热处理2～10min进行连接反应；（6）将步骤（5）的连接产物转化到感受态细胞，筛选含有A、B、C三个基因片段的重组质粒；（7）设计D基因的重叠引物，引物上含有步骤（6）中重组质粒上a酶切位点的末端碱基；（8）用步骤（7）中的重叠引物PCR扩增D基因片段，用a酶切位点对应的内切酶进行单酶切步骤（6）中筛选后正确的重组质粒，分别回收；（9）取15μL步骤（1）的1.33×连接buffer和步骤（8）中等摩尔数的各基因片段共5μL混合均匀，进行连接反应；（10）将步骤（9）的连接产物转化到感受态细胞，筛选重组质粒，该重组质粒仍保存着a酶切位点；（11）设计E基因的重叠引物，引物上含有a酶切位点末端碱基；（12）用步骤（11）中的重叠引物PCR扩增E基因片段，用a酶切位点对应的内切酶进行单酶切（10）中筛选后正确的重组质粒，分别回收；（13）取15μL步骤（1）的1.33×连接buffer和步骤（12）中等摩尔数的各基因片段共5μL混合均匀，进行连接反应；（14）将步骤（13）的连接产物转化到感受态细胞，筛选重组质粒，该重组质粒仍保存着a酶切位点；（15）设计F基因的重叠引物，引物上含有a酶切位点末端碱基,后同上。