[发明专利]一种耐贮猕猴桃新品种的选育方法

摘要

本发明公开了一种耐贮猕猴桃的选育方法，该方法包括（1）ACO基因的获得；（2）将ACO基因反向连接入双右边界双元载体，将载体转化入农杆菌中，通过叶盘转化法导入愈伤组织中，再通过筛选培养基获得抗性愈伤组织，经过分化培养基培养获得含有筛选标记的再生苗；（3）使用PCR法检测再生苗，获得阳性植株；（4）通过遗传分离获得无筛选标记的含有目的基因的植株。本发明的特点是将选择标记基因和目的功能基因分别构建到两个双元表达载体或同一质粒的两段不同T_DNA上，经农杆菌介导的遗传转化将目的基因和选择标记基因整合到不同染色体或同一染色体的不同部位，通过后代的筛选，获得无选择标记的转基因植株。

主权项

一种耐贮猕猴桃新品种的选育方法，其特征在于包含以下几个步骤：（1）ACO基因的获得，从猕猴桃叶片中提取RNA，再将RNA反转录成cDNA，最后通过设计引物获得ACO基因；（2）将ACO基因反向连接入双右边界双元载体，将载体转化入农杆菌中，通过叶盘转化法导入愈伤组织中，再通过筛选培养基获得抗性愈伤组织，经过分化培养基培养获得含有筛选标记再生苗；（3）上游引物为Term F: 5′‑GGT,GCT,TTC,CCA,GTC,CAA,ATC,GTT‑3′，下游引物为Term R: 5′‑CCA,GGT,TTA,GTC,GTC,TCG,TGT,CTG,GT‑3′，进行PCR扩增，80－105℃预变性3－10min后运行下循环，94℃ 35 s，59℃ 35 s，72℃ 40 s，共35个循环，最后72℃ 10 min，25℃ 30 s，取PCR产物5－30 μL进行0.6%－1.5％琼脂糖凝胶电泳分离获得阳性植株；（4）通过遗传分离获得无筛选标记的含有目的基因的植株，将同时含有hpt基因和aco基因的共转化植株转移至温室栽培，随机挑选其中10－50个T0代植株进行自交产生T1代后对T1代植株的基因组DNA进行PCR检测，从而获得无筛选标记的含有目的基因的植株。