[发明专利]重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法

摘要

本发明公开了一种可溶性重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法，包括以下步骤：克隆hVEGF165基因，得质粒hVEGF165/pMD20-T；构建表达载体pET32及pET28，得重组载体pET32/hVEGF165和pET28/hVEGF165；将重组载体转到宿主中，得转化子；转化子经IPTG诱导得Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白，再经镍亲和层析、PBS透析和超滤浓缩纯化；本发明以pET32、pET28为载体、优化诱导表达条件，最终高效表达Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白，既保证了两种蛋白的生物学活性，也高效地获得大量稳定蛋白。

主权项

一种可溶性Trx‑hVEGF165融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）克隆hVEGF165基因：用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20‑T载体，得质粒hVEGF165/pMD20‑T，经过测序确定为正确表达序列；（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32和步骤（1）所得的质粒hVEGF165/pMD20‑T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hVEGF165；（3）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选：将步骤（2）所得的重组载体pET32/hVEGF165转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从大肠杆菌TOP10菌株中提取重组载体pET32/hVEGF165；用热激法将重组载体pET32/hVEGF165转到大肠杆菌表达菌株BL21中，利用LB氨苄青霉素Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32/hVEGF165的大肠杆菌表达菌株转化子；（4）Trx‑hVEGF165融合蛋白的表达：将步骤（3）所得的pET32/hVEGF165大肠杆菌表达菌株转化子在35℃‑37℃培养至OD600为0.4‑0.8时，加入浓度为0.05‑1.0mM的IPTG，于16‑20℃诱导8‑12小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量可溶性的重组融合蛋白Trx‑hVEGF165；（5）Trx‑hVEGF165融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对Trx‑hVEGF165融合蛋白进行纯化，后再采用PBS透析和超滤浓缩。