[发明专利]一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱

摘要

本发明公开了一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱。包金线莲样品的预处理、各样品基因组DNA的提取、ISSR-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、构建各供试样品的ISSR分子标记指纹图谱和将构建的ISSR分子标记指纹图谱用于金线莲种质的鉴定。本发明方法节约了时间和经济成本，通过对金线莲属植物的DNA的提取，ISSR-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳就能得到准确可靠的鉴别图谱，该方法对外形上容易混淆的品种从遗传本质上鉴定，具有简便快捷、重复性好、分辨率高等优点，而且在幼苗期即可进行鉴定，对于保证霍山产金线莲药材基源的准确性和稳定性具有重要的作用。

主权项

一种鉴别安徽霍山产金线莲及其相似种的分子标记指纹图谱，其特征存在于包括以下步骤：（1）新鲜金线莲样品预处理将新鲜金线莲样品避光6个小时以上消耗淀粉，取新鲜的金线莲叶片10克，用50克以上无水乙醇浸泡二次，每次10分钟，擦干；（2）样品基因组DNA的提取采用改进的CTAB 法提取金线莲叶片基因组DNA，操作如下：1) 将预处理后的叶片放入冰冻过的陶瓷研钵中，并加入适量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末状，用药匙将叶片粉末迅速转移到10ml预冷Eppendorf离心管中，粉末的高度达到离心管的1/3处，停止加入粉末；  2)在离心管中加入4m1 65℃预热的CTAB提取缓冲液[2%(v/w)CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris‑HCl(PH=8.0)，2％巯基乙醇]；3)65℃温浴2h，中间每10min反转1～2次；4)15000rpm离心8min，将上清液转入另一离心管中；5)冷却至室温后，轻柔加入等体积的氯仿和异戊醇溶液，其中氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，轻缓颠倒40min；6)15000rpm室温离心10min，去沉淀，将上清液转入另一离心管中；7)在上清液加入2/3体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，－20℃放置1.5h以上；8)15000rpm离心10min，去上清液；9)用2ml 75％乙醇洗两次以去除盐，再用无水乙醇洗一次；10)倒去乙醇，37℃干燥20min，溶于600μL缓冲液，转移到1.5ml离心管中；11)加入5μL终浓度为50μL/mL RnaseA，37℃温浴1h；12)用等体积的酚、氯仿和异戊醇溶液对上述步骤(11)产生的溶液抽提2次，按体积比，酚：氯仿：异戊醇=25：24：1；13)15000rpm离心10min，取上清液；14)加入2倍体积的无水乙醇，‑20℃保温lh，每20min翻转一次；15)15000rpm离心，先用‑20℃预冷的75％乙醇溶液洗涤沉淀2‑3次，再用 无水乙醇洗涤一次。16)37℃温浴干燥DNA，加入100μLTE缓冲液溶解备用，4℃保存备用；（3）ISSR‑PCR扩增利用所提取的样品基因组DNA作为模板，在德国Eppendorf 5331梯度PCR仪上进行ISSR‑PCR扩增，PCR反应体系特征为：模板浓度25 ng/L，引物浓度0.5μmol·L‑1，Mg2+ 浓度2.0mmol·L‑1，dNTP 浓度200μmol·L‑1，Taq聚合酶浓度1 U/20μl；PCR扩增程序条件为：94℃预变性8分钟, 94℃变性45秒, 58‑62℃退火45秒,72℃延伸2分钟，扩增40个循环，最后于72℃终延伸10分钟；ISSR‑PCR扩增反应得到不同金线莲样品的扩增产物贮存在—20℃冰箱中；（4）琼脂糖凝胶电泳以4省10地金线莲的基因组DNA为模板，以其中两种引物进行 ISSR‑PCR 扩增反应，取扩增产物5μL‑15μL在1.5％的琼脂糖凝胶上于3V/cm的电压下电泳2.5h，经EB显色，并用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果；（5）各供试样品的ISSR‑PCR分子标记指纹图谱的构建把ISSR‑PCR扩增反应得到不同新鲜金线莲样品的扩增产物通过凝胶电泳，根据呈现的条带建立图谱：以金线莲品系编号为横坐标，以条带存在的位点编号为纵坐标，在每一纵横坐标交结处，有扩增带用“━”表示，没有扩增带不作标记，“有”带或“无”带以总亮度值作为选择依据, 采用Bandscan软件，选取亮度值在≥0.2为有扩增带，＜0.2的为没有扩增带；（6）将构建的ISSR‑PCR分子标记指纹图谱保存，用于鉴定金线莲把未知样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已得的金线莲指纹图谱相比较， 图谱相同即为安徽霍山产金线莲，否则不是安徽霍山产金线莲。