[发明专利]赤藓糖醇生产菌的选育方法

摘要

一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，属于微生物技术领域。该方法采用基因工程的手段对菌种进行改造以增加4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，原料中添加氯化铜，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的Yarrowialipolytica菌株进行选育，从而获得了Yarrowialipolytica赤藓糖醇高产菌株。其具体选育方法步骤包括：（1）基因工程改造、（2）培养基制备、（3）培养条件优化，获得高产赤藓糖醇生产菌菌种。本发明通过基因工程改造，避免了传统工艺的盲目性，同时减轻了后续大量的筛选检测工作，Yarrowialipolytica中4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加，有利于赤藓糖醇的生产。大大提高了赤藓糖醇生产菌的选育效率、菌种活力及产量。

主权项

一种赤藓糖醇生产菌的选育方法，其特征是首先采用基因工程的手段对菌种进行改造，以增加4‑磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的基因数量，然后对培养基组成及配比进行优化，原料中添加氯化铜，优化培养条件、对原本赤藓糖醇产量极低的Yarrowia lipolytica菌株进行选育，从而获得了Yarrowia lipolytica赤藓糖醇高产菌株；其具体选育方法步骤如下：（1）基因工程改造：4‑磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶是赤藓糖醇生产的关键因子；通过低温超声破碎、凝胶色谱分离技术及全波长分光光度计，分离得到这两种酶，分析获得了这两种酶的基因结构；然后用PCR扩增仪将获得的这两种酶的基因片段进行大量复制，PCR扩增的条件：90℃变性30 S、53℃退20 S，72℃延伸30 S；然后将得到的基因分别连接到pBR327质粒中；将质粒转化到Yarrowia lipolytica中，使其在细胞内大量拷贝；这样Yarrowia lipolytica中4‑磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的合成量大大增加，有利于赤藓糖醇的生产；将转化成功的Yarrowia lipolytica进一步富集培养，制成试管斜面在4℃冰箱中保存待用；（2）培养基制备：优化得到的培养基配比按重量计分别为：一水葡萄糖30%‑40%，柠檬酸铵1%‑2%，七水硫酸镁0.01%‑0.08%，氯化铜0.0003%‑0.0006%，110℃，灭菌20min；（3）培养条件优化：由于培养条件对于微生物的代谢有很大的影响，所以必须对Yarrowia lipolytica的培养条件从温度、通风两个方面进行了重复试验与优化；温度在28℃‑31℃时其他副产物最少；每分钟的通风量为料液体积的20%‑50%时，Yarrowia lipolytica细胞到达稳定期的时间比较短，最终获得的高产菌，最终获得的高产菌，并利于赤藓糖醇的生产。