[发明专利]PCR-核酸试纸条法检测人α珠蛋白基因缺失

摘要

本发明是一种在巢式PCR法特异性扩增靶模板的基础上结合核酸试纸条进行三种常见缺失型α-地中海贫血基因型检测的技术，其检测的主要原理是根据抗原和其特异性抗体的免疫学特异性结合，将核酸片段固定在核酸检测试纸条上，然后通过可视的呈色乳胶颗粒在试纸条上显色而检测出结果，在巢式PCR核酸试纸条法检测三种常见缺失型α-地中海贫血基因型中主要包括用于PCR扩增的特异性PCR扩增引物，一条5’末端带生物素标记的等位基因特异性引物，一条3’末端带FITC标记的特异性探针。

主权项

一种利用核酸试纸条检测缺失型α珠蛋白基因的PCR检测试方法，其步骤如下：a：取样，取待测样本于灭菌的0.2ml PCR管中；其特征在于：b：PCR扩增，先对特异性的靶模板通过普通的PCR进行扩增，PCR的扩增体系如下：（1）在灭菌的0.2ml PCR管中，在20ul的反应体系中，针对不同的基因型分别加入不同的PCR扩增引物PF/PR和探针P5B/D3F，同时加入一条5’末端带生物素标记的等位基因特异性引物，一条3’末端带FITC标记的特异性探针；（2）等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dTTP，dGTP，dCTP各0.2‑0.5 mmol/L；（3）10x反应缓冲液为2ul，其中分别为20mmol/L Tris‑HCl PH8.9，50mmol/L KCl，MgCl₂ 1.5mmol/L ；（4）分别加入提取好的人基因组DNA 4ul和石蜡油20ul，短暂离心后进行PCR循环，PCR循环参数为95 ℃ 5min；93‑96 ℃ 1min；60‑72℃ 1min；72 ℃ 2min；30‑50个循环；93‑96℃ 30s；45‑55 ℃ 1min；2‑10个循环；95 ℃ 5min；c：利用巢式PCR扩增对步骤b的产物进行第二步特异性扩增，在巢式PCR扩增过程中，将反应的退火温度将到适合P5B延伸的温度进行扩增；d：在试纸条上，将特异性抗A抗体吸附于乳胶颗粒，在乳胶颗粒表面形成抗体包被；将另一无色特异性抗B抗体，以线条状固定于膜上，形成检测线；e：检测：取反应产物5‑20ul，到核酸试纸条的加样处，加上100ul的缓冲液；约3‑5min后判读检测结果。