[发明专利]一种通过设计多克隆位点来构建真核表达载体的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过设计多克隆位点来构建真核表达载体的方法。本发明通过将真核生物基因启动子、转录终止调控序列、筛选标记基因、外源目的基因和原始骨架载体序列均没有的酶切位点连接在一起，然后再克隆到不含多克隆位点的原始骨架载体上，最后利用DNA重组技术分别将真核启动子、转录终止调控序列、筛选标记基因和外源目的基因插入到含有目的酶切位点序列的骨架载体上，获得真核表达载体。本方法不仅灵活实用，适合于构建所有简单和复杂的真核表达载体，而且克服了原始骨架载体上的固有多克隆位点不能满足要求的缺点；在确定了合适的酶切位点后，后续载体构建工作快捷、高效，加快了实验室真核生物基因功能研究的进程。

主权项

一种通过设计多克隆位点来构建真核表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、克隆真核生物的基因启动子和转录终止调控序列：提取真核生物基因组DNA，扩增真核生物的基因启动子和转录终止调控序列，克隆到T克隆载体上，经测序鉴定，获得其序列；B、对目的片段进行酶切位点分析：对真核生物基因启动子、转录终止调控序列、筛选标记基因、外源目的基因和原始骨架载体全序列进行酶切位点分析，根据插入片段的数量选择上述序列上均没有的酶切位点的数目；C、合成目的多克隆位点：按照目的片段插入的先后顺序将步骤B中选取的多个酶切位点连接到一起，组成多克隆位点序列，酶切位点之间插入3～12个碱基隔开，多克隆位点序列两端加4～6个保护性碱基，将多克隆位点序列克隆到不含多克隆位点的原始骨架载体上，通过测序分析，获得正确的骨架载体；D、构建真核表达载体：通过DNA重组技术，将真核表达载体关键元件分别插入步骤C获得的正确的骨架载体，得到新的真核表达载体。