[发明专利]一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法

摘要

本发明涉及一种微生物驱油藏内源产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，针对产脂肽类表面活性剂微生物脂肽合成酶基因设计引物，进行荧光定量PCR。在优化的反应程序和反应体系下，以从标准产脂肽菌株中获得的脂肽合成酶基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品，将此标准品进行10倍梯度稀释作为模板进行荧光定量PCR绘制标准曲线，将微生物驱油藏样品经简单处理作为模板进行荧光定量PCR，根据线性关系R2和扩增效率E来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。本发明使用脂肽合成酶特异引物在优化的反应条件下检测油藏产脂肽类表面活性剂微生物时，具有更高的稳定性和灵敏性，可广泛应用于微生物采油提高采收率领域。

主权项

一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，包括以下具体实施步骤：（1）、设计和合成引物在GeneBank中搜索产脂肽类表面活性剂微生物的脂肽合成酶基因，对其同源性进行比较，选择基因的保守区序列，按照引物设计原则设计一对引物；（2）、荧光定量PCR反应程序和反应体系的优化和建立通过对Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的选择，以最低Ct值和最高RFU为筛选指标，确定反应体系和反应程序；（3）、标准品质粒的制备应用PCR技术从产脂肽微生物枯草芽孢杆菌中获得脂肽合成酶基因片段，与T载体连接，构建重组质粒，测定重组质粒A260计算质粒拷贝数，此计算出拷贝数的重组质粒即为实时定量PCR的标准品质粒；（4）、建立标准曲线取步骤（3）标准品质粒，以10倍的倍比关系进行梯度稀释，分别作为qPCR（实时荧光定量PCR）反应的模板进行扩增，以不同稀释梯度质粒拷贝数的对数值对相应的阈值循环数做图，制作标准曲线；（5）、方法灵敏度和稳定性考核① 方法灵敏度考核将按10倍稀释，拷贝数为1×107 copies/μl～1×101 copies/μl的标准品质粒做为模板，步骤（2）中的反应体系和反应程序分别进行检测，考察检测下限，对灵敏性进行评价；② 方法稳定性考核分三天分别进行三次独立试验，每个浓度做三个平行，通过对实验结果Ct值的平均值和变异系数来评价方法的稳定性或可重复性；其特征在于，所述步骤（1）中的引物对序列为：srfAF 5’‑CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG‑3’srfAR 5’‑TCA TAR AGC GGC AYA TAT TGA TGC‑3’所述步骤（2）中的反应体系设为20 μl，体系组成：反应缓冲液为10×Taq PCR buffer，Mg2+浓度为3.5mM，dNTPs浓度为0.2mM，Taq酶2.5U，引物的浓度均为0.1μM，20×Sybr Green I 1μl，模板 2μl，无菌水7μl；所述步骤（2）中的PCR反应程序为：① 预变性95℃ 5min，② 荧光收集，95℃15s 58℃15s 72℃20s，每个循环结束后进行荧光信号收集，扩增40个循环，③ 溶解曲线分析，65℃逐步升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光。