[发明专利]甘蔗褐锈病菌PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种甘蔗褐锈病菌的PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测。本发明的甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。为甘蔗褐锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗褐锈病菌的早期诊断及检测，对我国抗褐锈病甘蔗育种和抗褐锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。

主权项

一种甘蔗褐锈病菌的PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于： （1）PCR检测体系的建立： PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl2，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 μmol/L 的检测引物PCR‑F和PCR‑R各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20‑30 ng基因组DNA，ddH2O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃8 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris‑HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2；所述检测引物如下：  PCR‑F：5'‑GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA‑3'，PCR‑R：5'‑GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA‑3′；   （2）PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为483 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗褐锈病菌存在的标志。